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科學是簡單常識在其最佳。~Thomas Huxley
獲得高質量, 原封核糖核酸是一並且最重要的步驟在執行許多根本分子生物學經常試驗, 包括北分析、nuclease 保護檢驗、RT-PCR 、核糖核酸映射, 體外轉換和DNA 圖書館建築。成功, 然而, 核糖核酸隔離程式應該包括一些重要步驟兩個在實際核糖核酸洗淨前後。
根據核糖核酸被提取, 有允許它與其它蜂窩電話材料被隔絕譬如蛋白質、DNA 和甚而油脂核糖核酸的屬性。
信使核糖核酸或mRNA 包含舒展adenosine 殘滓以poly(A) 尾巴的形式。這被剝削允許mRNA 一定對poly(T) 親合力列或小珠。
如果您當前有一個更喜歡的方法為隔絕核糖核酸, 繼續使用它。
如果您未隔絕核糖核酸從您的系統在和您的有機體不是在以下列表之前, 我們能幫助您辨認被使用了為隔絕核糖核酸為北弄髒或RT-PCR 從您的系統的被設立的協議。這些類型協議並且將產生"microarray 級別" 核糖核酸。
總運行您的核糖核酸agarose 膠凝體估計質量。
注: 如果您使用一種非列基於的洗淨試劑譬如我們推薦您沉澱您的核糖核酸第二次從對氨基苯甲酸二或的TRIzol 您通過它通過Rneasy 列或相似的設備。這保險所有有機汙染物撤除(參見光譜下面) 。
高效率的nuclear/cytoplasmic 分餾可能由弈質的agarose 膠凝體分析快速估計(參見圖1) 。範圍對應於前體rRNA 應該是等效的在總和核核糖核酸分數。18S 和28S rRNA 範圍將是較不強烈的在核核糖核酸分數比在或總額核糖核酸或細胞質分數核糖核酸裡。在一些電池線路, 例如293 和COS-7 電池, 這差額將是劇烈的, 但在其它電池線路譬如海拉電池, rRNA 範圍是少許較不強烈的在核核糖核酸裡比在總或細胞質分數核糖核酸裡。"
A260 讀取和260/280 比率不是足夠保證高純度核糖核酸。您必須採取一個充分的紫外光譜。下面是所有有好260/280 比率的3 個實例光譜, 但有非常不同的純淨。您能並且使用260/230 比率對幫助確定相當數量有機汙穢在您的核糖核酸裡。這比260/280 比率是一個更加可變的編號, 但常規, 比率在1 之上表明好純淨。
電池然後被洗滌了在PBS 和連續地提取了如所描述。首先, 電池被提取了以Nonidet P-40 緩衝(10 毫米Tris Cl, (酸鹼度7.5), 10 毫米NaCl, 3 毫米氯化鎂, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 毫米DTT) 。殘餘的藥丸(粗礪的內質蜂巢胃(RER) 並且中堅力量) 被洗滌了在同樣緩衝和被提取了在緩衝B (10 毫米Tris Cl (酸鹼度7.5), 10 毫米NaCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 毫米EDTA, 40 units/ml Rnasin, 1 毫米DTT) 。殘餘的核藥丸被洗滌了在同樣緩衝和被提取了以高鹽緩衝(10 毫米Tris Cl (酸鹼度7.5), 0.5 M NaCl, 3 毫米氯化鎂, 0.5%(v/v) Nonidet P-40 、40 units/ml Rnasin, 1 毫米DTT) 。核糖核酸被淨化了從各個分數由核糖核酸STAT 解決方法。總核糖核酸被隔絕了使用RNA-STAT60 試劑(電話測試) 根據指令由製造商提供。(參考: Byeong-Churl Jang 等, 2002)
為100 mls 200 mls
4 。5M Guanidinium 硫氰酸53.2 g 106.4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM EDTA 0.5M 10 mls 20 mls 25mM Tris-HCl, 酸鹼度7.5 1M 2.5 mls 5 mls
0 。1M b □基乙醇700ul 1.4mls
0 。2% antifoam A (斯格碼) 200 ul 400 ul
5 。7 M CsCl 坐墊* 最終數量100 機器語言
5 。7 M "被烘烤的" CsCl 95.8g
0 。1M EDTA 0.5M 20 mls
* 使用DEPC 被對待的水和被烘烤的玻璃器皿。這個解決方法必須任意正, absolutely, 是Rnase 。Rnase 是到處! 佩帶手套、用途唯一被烘烤的玻璃器皿, 或處女塑料。DePC 款待您的水, 緩衝(除了Tris) 。非常小心。
1 。稱動物。去除器官(肝臟), 衡量DNA 的當中一個優越屬性是您減少基因複雜由選擇只表達multilocus 酵素的一個唯一所在地的器官。2 。迅速地使組織均勻在"紛亂" 緩衝(9mls) 3 。轉動homogenant 在12 公斤取消不能溶解的物料4 。當Homogenant 轉動4.A 。稱重1.8 g CsCl (0.2g/ml) 每範例。4B 。在高速離心器管("快速密封") 添加3.5mls 5.7M CsCl "坐墊" 這塊層必須任意是Rnase 。您將分離您的核糖核酸通過這塊層並且任一汙穢將導致重大損失。5 。去除supernant, 投入入新鮮的管, 加1.8 g CsCl 6 。仔細地, 添加homogenant 在CsCl 坐墊頂部。這是欣然成功的由使用10cc 注射器和長式針。安置needle/syringe 入快速密封管, 和添加組織homogenant 來注射器。Homogenant 慢慢地將滴下入Q-S 管, 浮動在坐墊頂部。
7 。仔細地, 平衡被符合的成對離心機管(+ 0.005 g) 。
8 。密封管、安排被符合的管對面彼此和蓋帽以紅色鋁頂層。
9 。離心機, 50,000 rpms 5.5 時數, 20oC
在離心法以後: 標記藥丸應該是的管: 在底下外面邊(相對電動子的中心)
10 。去除管, 安置在方便機架裡。
11 。切tube.Aspirate 頂層名列前茅2/3- 3/4 解決方法。工作從頂層下來。它重要, 您首先吐氣較大多數解決方法和去除所有除了清楚的坐墊。不要吐氣無形的藥丸在底層。
12 。切除管的名列前茅2/3 。使用"被拉扯的" Pasteur 吸取, 仔細地去除剩餘解決方法。藥丸將是在管的底層邊。
13 。漂洗藥丸與70% EtOH, 去除(用途Pasteur 吸取), 重複得兩次(總額3 洗滌)
14 。添加0.1x TE (RNase 200 ul 自由), 使用吸取要訣來易碎藥丸和"滴定" T.E. 企圖投入藥丸入解決方法。至少形成一個異種解決方法和投入入一支新鮮的microfuge 管。
15 。重複以T.E. 200 ul 合併兩個解決方法
16 。漩渦, 好核糖核酸不喜歡進入解決方法。耐心是賢良。
17 。確定濃度, 10 ul 入490 ul (500 ul 最終卷)
18 。取消1 到2 ug 核糖核酸為膠凝體分析(添加核糖核酸裝載緩衝)
19 。任意添加1/10 數量Rnase 3M NaOAC (40 ul), EtOH 的2.5 數量(1.0ml) 。混合蒼勁。
20 。您能計算核糖核酸的濃度在EtOH.Thus, 那裡是沒有需要立即沉澱所有您的核糖核酸。取消大約1.5 到2 倍您需要由vortexing EtOH/RNA 解決方法的金額並且請取消適當的數量。這個EtOH/RNA 解決方法被存儲在20oC 或降下, 是穩定幾年來。
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