北汙點
版權2007 年- 分子崗位
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傾聽一個詳細的北汙點解釋!
北弄髒的歷史記錄
北弄髒是1977 年被開發由Alwine 等在斯坦福大學的核糖核酸弄髒的技術(ref:1) 。它命名以 弄髒為 DNA 的南部的汙點技術, 1975 年由Edwin M. Southern 發明。 西部汙點, 1981 年一個方法為弄髒為蛋白質並且是戲劇在南部的汙點命名和被命名了(ref:2) 。
背景資訊- 北汙點技術
北分析儘管其年齡在實時PCR 、nuclease 保護檢驗(RPAs) 並且microarrays 高技術世界, 是仍然金子標準為mRNA 級別的檢測和測量。這是因為北汙點分析允許信使核糖核酸豐盈的一個直接比較在範例之間在一個唯一膜。
在北汙點主要差額在其它弄髒的技術之間是, 核糖核酸是系數被檢測。並且, 由於這樣的事實核糖核酸通常唯一擱淺, 它創建影響其遷移並且因此弈質情況被使用運行膠凝體的複雜附屬結構(不同於南部) 。
核糖核酸由RNA 膠凝體 電泳法(通常 agarose 膠凝體電泳法), 隨後調用到膜, 雜交以探針, 和最終檢測分離。
同樣與南部弄髒, 雜交探針也許是DNA 或核糖核酸在北弄髒。
程式的變形以反向北汙點著名(雖然, 少有地) 偶爾地被使用了。在這個程式, 被添加膜) 是被隔絕的DNA 片段的一件收藏品的基體核酸(, 和探針是核糖核酸從組織被提取和放射性地被標記。
對進入了普遍用途在90 年代和早期的2000s 晚期的DNA microarrays 的用途是如同對反向程式, 他們介入對被隔絕的DNA 片段的用途被添加基體, 和雜交以探針由蜂窩電話核糖核酸被做。因而反向程式, 雖然原始不凡, 被啟用基因表達的一在時間研究使用北分析轉變成基因表達描出, 許多(可能所有) 基因在有機體也許有他們的表達式監控了
北汙點的申請
北汙點是superceded 在多數面積由實時PCR 和microarray 途�&。它經常不被使用為臨床或診斷目的。
北汙點協議和其差異被使用然而在分子生物學研究:
- 一金子標準為基因表達的直接研究在mRNA (信使核糖核酸抄本的) 級別。
- mRNA 抄本範圍的檢測
- 研究核糖核酸退化
- 研究核糖核酸接合- 能檢測替代被接合的抄本
- 學習核糖核酸半衰期
- 研究怒火(內部ribosomal 項站點) - 去除核糖核酸消化的可能性對第2 個cistron 轉換。
- 經常□去□常證實和檢查transgenic/擊倒滑鼠(動物)
不利北弄髒
不利使用北弄髒有:
- 經常放射線被使用。這防止執行它, 用途和處理舒適。非放射性的檢測新建方法被生成了允許非放射性的檢測。參見皮爾斯。
- 北弄髒的整體進程通常需要久時間, 從範例準備通過對檢測。
- 如果核糖核酸範例是均勻的由RNases 輕微地貶低, 表達式的資料和測量的質量是相當負受影響的。
- 標準北汙點方法比nuclease 保護檢驗和RT-PCR 相對地較不敏感的。北汙點敏感性也許被增加以對尼龍positively-charged 膜的用途, 對一根高特定antisense 探針的用途。
- 檢測以多根探針是問題。經常, 膜必須被剝離在雜交和檢測之前以第二根探針。這是問題因為苛刻的情況必需從汙點剝離探針和還費時。並且, 有限額對汙點也許被剝離的時間。
好處北弄髒
北汙點好處有:
- 這是一個廣泛被接受的和很好被看待的方法
- 北弄髒是一個直接的方法
- 經常它被使用作為確認書或支票
- 經常金子標準
- 這是一個多才多藝的協議因為它可能允許許多類型用量探針(對實時PCR) 有: radiolabeled 和非radiolabeled, 體外被抄錄的核糖核酸和甚而oligonucleotides 譬如底漆。
- 順序以甚而部分同源, 不同於實時PCR 或其它方法可能被使用當雜交探針(即順序從另外種類為同源分析, 甚至genomic 片段可能被使用) 。
北汙點協議
如同提及步驟在北弄髒有:
- 核糖核酸隔離
- 核糖核酸膠凝體電泳法為分離
- 調用到膜(通常positively-charged 尼龍作為核糖核酸negatively-charged)
- 核糖核酸Cross-linking 對膜(通常通過紫外交互相聯或化學製品平均值)
- 雜交
- 檢測
材料需要為北汙點協議
緩衝食譜
20XSSPE (500 機器語言)
- 3.6M NaCl: 105.2 g
- 0 。2M 磷酸鹽緩衝酸鹼度7.0: 1M 100mL
- 20mM EDTA: 20mL 0.5M
磷酸鹽緩衝pH7.0 (500ml)
- NaH2PO4 (一價的) 140 機器語言1M
- Na2H2PO4 (二元) 360 機器語言1M
- 酸鹼度到7.0 在兩個以後被添加
雜交緩衝= HB (100mls)
- 5X SSPE: 25mls 20X
- 2% SDS: 20 mls 10%
* * 正確使用任意以前添加1000ug 被弈質的RNAse CT DNA (熱對95.o 3 分鐘弈質) 5000ug 酵母核糖核酸
洗滌: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls
20X 5 mls 10% SDS = 0.1% SDS
連續緩衝為核糖核酸膠凝體(1L)
- 100 mls 10X 擦
- 52 。甲醛6 mls
- 847 。4 mls H20
核糖核酸膠凝體(70ml)
- 0.84 g agarose
- 7 mls 10x 擦
- 58.38 mls H2.O
- 投入膠凝體在解決方法由熱化。讓膠凝體冷靜對60.C, 然後添加甲醛來等於0.66M -- 3.78 mls
- 傾吐膠凝體在發煙敞篷裡如果可能
核糖核酸範例為北汙點
參見 核糖核酸隔離和洗淨
核糖核酸膠凝體
在隔絕核糖核酸以後, 核糖核酸必須被分離在膠凝體(通常agarose) 。
參見 核糖核酸膠凝體
北汙點調用到尼龍膜協議
在運行 核糖核酸膠凝體以後, 洗滌膠凝體與蒸餾水把放在posiblotter 上。
層從頂向下是:
- 海綿
- 3-4 Whatman 紙剪切對範圍(這兩上述應該被浸泡在10X SSPE 但不滴下)
- 膠凝體屏蔽。
- 注: 確定膠凝體重�&屏蔽以便它可能密封膜以膠凝體頂層的線路並且正確的頂面角落標記了3 個片斷輕微地更大的3M 紙堅硬塑料以�&洞
鉗位和確定有一個好密封。使用75-80 毫米百克壓力1 個小時或更多。
弄髒膜乾燥
Cross-linking 尼龍膜- 北汙點協議
- 剪切右上角換行在薩冉樹脂換行裡。
- 紫外照耀以核糖核酸邊下來2.5 分鐘。
- 洗滌兩三分鐘在熱的2X SSPE/0.1% SDS 解決方法(微波解決方法30-45 秒在50% 力量。
- 宣揚乾燥
前雜交為北汙點
- 前雜交6 時數隔夜
- 設置烤箱對65.C 熱HB 緩衝投入SDS 在解決方法
- 滾動膜在濾網裡面片斷和投入入hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS)
- 檢查氣泡
- 投入管在烤箱被平衡與其它管在反面
標記的探針為北弄髒
- 投入探針25ng 在11uL 的一個總數量與ddH2.O
- 弈質@ 95.C 3 分鐘。這將得到探針唯一擱淺和去除�&防止高效率的雜交的附屬結構。
- 快冷卻在濕冰。這將保留探針唯一擱淺, 免於附屬結構和不允許reannealing (或改革附屬結構) 。
- 添加4.ul 高頭等(Boehringer 曼海姆) 5.ul 阿爾法radiolabeled P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul 總額
- 孵化10-15 極小的37.C
- 添加1X TE, 2.ul 0.5M EDTA 28uL, 來20ul 回應。
- 前轉動G-25 Sephadex 列為1 分鐘。
- 添加50ul 範例來列和轉動2.5 分鐘在臨床離心機。這將淨化探針從標籤。
- 投擲列。
- 混合在新建管100ug CT-DNA 50ug 酵母核糖核酸在0.5mL 管。
- 弈質95. 3 分鐘
- 添加來雜種管混合, 雜交在65.C 20-36 時數
張貼雜交協議為北弄髒
雜交36-48 時數然後洗滌。
- 加熱2X SSPE/0.1% SDS (洗滌) 熱由65. C 決定(用途微波或熱水鍋溫暖解決方法)
- 去掉管和傾吐液體入熱的放射性廢物容器。
- 沖洗以10ml 洗滌做這兩次和傾吐廢物。
- vigoursly 投入在洗滌和震動40 到50 mls 。
- 投入在雜交烤箱為20 極小轉動。
- 傾吐在水槽下
- 其他40-50mls 和震動在烤箱。
- 傾吐到廢容器(水槽如果不熱或含毒物) 並且確定天氣不再熱的和然後去掉膜。
- 洗滌在振動器與0.2XSSPE 以0.1% SDS 在RT 15 分鐘。
- 宣揚乾燥
- 曝光
要訣為北汙點
如果您當前有一個更喜歡的方法為隔絕核糖核酸, 繼續使用它。
總運行您的核糖核酸agarose 膠凝體估計質量。不僅依靠分光光度學結果。
* 使用DEPC 被對待的水和被烘烤的玻璃器皿。這個解決方法必須任意正, absolutely, 是Rnase 。Rnase 是到處! 佩帶手套、用途唯一被烘烤的玻璃器皿, 或處女塑料。DePC 款待您的水, 緩衝(除了Tris) 。非常小心。
解決困難的北汙點
如果您當前有一個更喜歡的方法為隔絕核糖核酸, 繼續使用它。
討論和張貼問題對此在 北汙點論壇。
北汙點參考
- Alwine JC, Kemp DJ, 純然的GR (1977) 。"方法為特定RNAs 的檢測在agarose 形成膠凍由調用到diazobenzyloxymethyl 紙並且雜交與DNA 探查" 。Proc 。全國。Acad 。Sci 。美國。74 (12): 5350-4 。
- W. Neal Burnette (1981 4月) 。"' 西部弄髒':
蛋白質從鈉dodecyl sulfate polyacrylamide 膠凝體到 — 非限定的硝化纖維素和幅射線照相的檢測電泳調用與抗體和radioiodinated 蛋白質A "。肛門Biochem 112 (2): 195-203 。
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