西部汙點

現在瞭解一切別的東西那裡是關於西部汙點!

-範例Prepartation

-溶解緩衝

-抗體

-溶解電池

-膠凝體準備

-運行的膠凝體

-膠凝體調用

-控制

-西部汙點

-讀出

-分析和解釋

您是否有非依附電池(例如T細胞線路或外圍血細胞)或依附電池(例如成纖維細胞電池或COS電池)，您需要從媒體取消額外的蛋白質。 對於非依附電池您能輕輕地射擊他們與離心法然後洗滌與PBS的藥丸。 為依附電池、簡單的與PBS的洗滌燒瓶或盤在西部汙點之前。

西部汙點分析檢查蛋白質，和，因此我們希望蛋白質是從電池的版本並且防止蛋白質切開由蛋白酶。 我們需要這些對西部汙點：

-保持事情冷! 在冰的4C在西部弄髒的電池病勢漸退期間

-使用洗滌劑破壞電池的膜發行蛋白質

-緩衝

-抗化劑(蛋白酶分解抑製劑和磷酸酶抗化劑，如果我們將執行磷蛋白質的西部汙點)

洗滌劑-溶解西部汙點的電池

SDS和RIPA是使用西部弄髒，被用於溶解最新分析的蛋白質的洗滌劑。 需要這許多蛋白質是在電池或被找出的裡面細胞膜裡面，因此我們需要發行這些蛋白質能對他們的immunoblot。

您應該選擇抗體為西部汙點使用。 通常使用鼠標單克抗體或兔子多無性繁殖系的抗體。

您能使用或者抗體，不用任何被添加的組，或者使用被共軛對生物素的抗體。 這些抗體不要求

多無性繁殖系與西部汙點的單克抗體

單克抗體為西部弄髒通常是好由於：

-更好的針對噪音的信號比例(在西部汙點的更低的背景)

-他們的更高的特異性(您獲得較少沾染的蛋白質或Ig)

-在西部弄髒的影片(較不檢測的未指明的範圍的整體擦淨劑結果)

多無性繁殖系的抗體更好地適合免疫沉澱反應：

-他們認可更多表位

-有更高的慾望

在您之前的技巧為西部弄髒溶解：

如果您去蛋白質質量的(ie西部汙點不是磷酸化的)的蛋白質：

-您在更大的數量能溶解(保留其它為其他蛋白質弄髒)

如果您去西部汙點磷蛋白質(或磷酸化的蛋白質)執行以下是重要的：

-確定您使用磷酸酶抗化劑(例如釩酸鹽，因為磷酸酶從您的蛋白質將取消磷酸鹽! )

-也溶解在可能最小的數量的電池(ie在100 ul裝載緩衝，這溶解執行，因為您能裝載您溶解的大多電池。 這是重要的，雖然信號是相當弱的，當西部弄髒磷蛋白質的。)

如果您查看蛋白質蛋白質交往：

-不要使用SDS，它離解蛋白質蛋白質交往，并且蛋白質因而被弈質(特別是在煮沸以後)

-為西部弄髒的蛋白質蛋白質交往， ie當地交往您必須使用一種嚴密洗滌劑這樣RIPA。

溶解：

-直接地在牌照或盤能執行

-射擊電池

-保持在冰和寒冷-使用一個冰桶

-多少病勢漸退緩衝的概測法能使用是： 10^5電池/病勢漸退緩衝uL

-收集在eppendorf管并且標記(保留這些在冰)

在西部汙點分析之前評定總蛋白含量：

如果您想要比較在西部汙點分析的處理條件-這允許定量分析

-商業工具箱是可用的例如布雷得佛檢驗為評定總蛋白含量(從生物Rad)

- 0.1% SDS或更加極大可能干涉蛋白質評定

弈質蛋白質範例：

-添加蛋白質裝載範例緩衝到整除數電池lysate -包含染料(也看到在膠凝體， 2% SDS)的遷移

-添加二硫化物脫氧劑例如beta -巰基乙醇

-在熱水鍋或熱化塊的煮沸(低溫例如中間的90個程度減少蛋白質彙總)。

-戳在每支管蓋帽的一個漏洞防止彈出

SDS-PAGE膠凝體是範圍用於在電流面前分隔蛋白質的膠凝體矩陣。 低百分比膠凝體分隔更大的蛋白質，而更高的百分比膠凝體更好分隔更小的蛋白質。 問題是所有蛋白質有充電關聯與他們，并且在電流這可能引起問題。 這由SDS的添加對蛋白質範例的解決。 SDS束縛對蛋白質每少量氨基酸并且中立化蛋白質有的充電區別。 這允許蛋白質分隔由範圍和不由充電。

-根據多少蛋白質您將想要為西部弄髒裝載，您應該使用小的梳子或更大的梳子。

-丙烯酰胺的百分比是重要的。 使用通常10%丙烯酰胺。

-一個解決的膠凝體使用在與酸碱度的底層8.8

-一個堆積的膠凝體(4-5%)酸碱度6.8被用於在裝載以後包裝蛋白質一起

-催化劑增加膠凝體的聚化加速聚化回應的APS和TEMED (形成和固體化)聚丙烯酰胺凝膠。

-仔細裝載每個範例和遲緩地防止洩漏在運輸路線外面的範例。

-裝載每個運輸路線并且使用範例緩衝在其中每一(防止區別)。

1. 分離10秒數的範例在煮沸以後。
2. 裝載範例到每個運輸路線
3. 裝載兆瓦參考
4. 運行膠凝體在100V (恆定的電壓)甚至改善在40 mA (恆定的當前)。 何時的注意蛋白質標記或梯子或者洗染前面能終止膠凝體。 如果您有時間，恆定的當前產生更好和更加急劇的結果。

-注意泡影在玻璃之間和在膠凝體之下-這意味著它運作

-，如果不是您切換了線索，并且能丟失所有您的範例， -注意蛋白質遷移(應該斷開)!

-通過堆積的膠凝體(~ 50伏特)，這遲緩地最初運行產生更加鋒利的範圍。

-隔夜不要運行

-不要過度加熱膠凝體(這造成膠凝體丟失堅硬，導致resoloving的貧寒和模糊的非常被形成的範圍)

選擇膜類型：

能使用：

-西部汙點的PVDF膜

-西部汙點的硝化纖維素膜

-尼龍膜(很少使用的現在可能撕毀)

調用的技巧到西部膜：

-一直穿戴手套! 使用鑷子

-使涉及或鑷子減到最小到膜

生物RAD轉帳單：

(-)
在黑色的海綿
濾紙
膠凝體硝化纖維素
濾紙
海綿
(+)

調用：

-保留冷靜在4C

-隔夜調用在35 V

-能在1時數迅速調用在更高的V

阻攔膜允許您最大化信號：噪聲比例

-穿戴手套

-與5%的塊爛醉(脫脂牛奶-粉末)或1 - 5% BSA (遲鈍的乳清蛋白)磷酸化的蛋白質的。

-緩衝是TBST

洗滌在阻攔以後

-洗滌在阻攔步驟以後在主要抗體孵出期間不是重要的，因為人經常塊。

-洗滌物通常完成與TBST緩衝。 能迅速執行與大容量TBST。

與主要抗體的孵出

-鼠標、兔子或者其他種類

-通常1 ： 1000年與TBST的稀釋

-，如果強背景或許多未指明的範圍是問題，孵出可以完成與5% BSA或牛奶。

洗滌在主要抗體以後

-不那麼重要

-能迅速洗滌與TBST的大數量

附屬抗體的孵出

-通常被稀釋的1 ： 10， 000與TBST

-反鼠標、反兔子，或者其他抗體共軛與檢測的HRP酵素

洗滌在附屬抗體以後

-重要

-洗滌5 X與TBST的5分鐘。

-，如果您必須確實衝，洗滌與TBST的更大的數量的至少3次。

檢驗結果的

-通常使用ECL (改進的化合光)

-影片顯示并且被開發。 風險10秒是足够通常為總蛋白含量。 磷蛋白質可能要求2個- 20個周詳風險。

-影片通常是XOMAT或相似的『快速』影片

WB -西部汙點

IB - immunoblot (西部弄髒的另一個術語)

SDS -鈉十二烷基的硫酸鹽(用於許多西部弄髒的解決方法的洗滌劑)

頁- Polyacrilamide膠凝體電泳法

Ab -抗體(抗體被用於檢測您的蛋白質利益)

HRP -辣根過氧化物酶

Luminol - HRP劈開導致輕的形成的基體

ECL -改進的化合光(提高輕的形成HRP + Luminol)的西部汙點解決方法

kD/kDa - kilodalton (在30 - 80 kDa之間的多數蛋白質平均數)

RAM -兔子反鼠標Ig

Ig -免疫球蛋白(抗體同形象)

NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - phenylmethylsulfonyl氟化物

BSA -遲鈍的乳清蛋白

NFDM -脫脂牛奶