Bioinformatics, 協議, DNA 核糖核酸蛋白質Proteomics

家庭 > 蛋白質 > 排錯西部弄髒 > index.php

解決困難的西部汙點

  分子崗位指南對於西部弄髒的問題和解決方法: 公用西部汙點問題和解決方法為他們!

請 與我們聯繫 以您的想法如果您能補充說來這個指南。

 

什麼是您的西部汙點問題? - 按字母順序組織

模糊的範圍

低信號

膜發光在暗室

強背景

地點在影片

許多個範圍在西部汙點

微弱的信號

 

 

解決困難的西部汙點問題:

地點在影片(錯過的範圍) :

- 貧寒調用由於氣泡在調用期間到膜

- 骯髒的影片當添加來開發員

- 開發員卷是骯髒的

對地點的解決辦法在影片:

- 使用一根pasteur 吸移管作為路輾卷膜和形成膠凍在調用之前取消泡影保留膜和材料濕。

- 保持影片乾淨在添加來開發員之前

 

解決困難的西部汙點問題:

許多個範圍在西部汙點:

- 通常由於許多未指明的範圍

- 粗劣的主要抗體質量或老抗體

- 不足夠阻攔

- 抗原蛋白水解的卵裂- 所有額外範圍是更低的兆瓦比您的蛋白質, (ie 您的蛋白質被檢測但被貶低了)

對許多個範圍的解決辦法在西部汙點:

- 採購其它抗體或用一個新鮮的抗體股票替換

- 塊用5% 無脂肪牛奶粉或BSA 在添加前主要。如果您已經阻攔, 考慮阻攔在主要和附屬抗體孵出期間和並且增加阻攔牛奶或BSA 濃度。

- 保留一切在冰, 使用新鮮的範例, 存儲- 80C, 和使用protease 抗化劑譬如PMSF

 

解決困難的西部汙點問題:

強背景; 低針對噪音的信號比率在西部汙點

- 黑色或每部黑暗的影片; 影片太長期被暴露了

- 阻攔是不足的; 主要抗體未指明的捆綁和附屬抗體沒完全地被洗滌了

- 洗滌物是不足的

- 影片發光在黑暗! - 太高附屬或主要稀釋

對黑暗的影片的解決辦法:

- 曝光為較少時間, 減少曝光時間

- 增加阻攔無脂肪牛奶粉5% 孵出的期限或增加濃度。

- 您能並且設法阻攔與主機動物的整體清液與(或以前) 附屬抗體

- 增加洗滌的時期並且數量對幫助去除任一個未指明的信號由於微弱的抗體捆綁。

- 使用一種更強的洗滌劑洗滌- 代替TBST (非離子活性劑20), 使用更強的洗滌劑譬如也許提供一次更加嚴密的洗滌和減少背景(的NP-40 或SDS 做這只如果您結合是強的! - 並且洗滌去除某一您的範圍利益!)

- 非常高附屬抗體(甚至主要) 濃度- 執行優化實驗確定適當的抗體稀釋進一步稀釋抗體。

 

解決困難的西部汙點問題:

低信號 或微弱的信號

- 由於沒有足夠的蛋白質裝載了在膠凝體

- 主要抗體是老或不好的

- 磷蛋白質通常需要隔夜主要抗體孵出

- 沒有足夠的附屬抗體

- 在阻攔

- 顯現出的試劑是壞/您犯了錯誤當準備他們

對低信號或微弱的信號的解決辦法:

- 裝載更多蛋白質範例膠凝體

- 嘗試新鮮的主要抗體

- 孵化主要抗體overnite 為磷蛋白質在4 攝氏度(冷室振動器)

- 增加蛋白質的濃度(溶解範例在較少病勢漸退緩衝)

- 減少阻攔的座席的濃度

- 檢查顯現出的試劑; 準備新ECL 和re ECL 膜

- 增加濃度或主要抗體潛伏期的長度

- 增加濃度或附屬抗體潛伏期的長度

 

模糊的範圍, 範圍被抹上, 範圍不鋒利

- 範圍被抹上的由於熱的膠凝體

- 範圍模糊由於高壓

對模糊的範圍和不鋒利的範圍的解決辦法:

- 減少電壓或當前, 運行在冷室, 和準備新建連續緩衝(熱導致膠凝體丟失其堅硬和其分辨能力)

- 前浸泡調用膜在適當的調用解決方法(由膜製造商確定) 為必需的時間。