西部汙點

西部汙點協議

西部弄髒的協議

西部弄髒協議

範例的準備為SDS-PAGE 膠凝體電泳法從準備的電池Lysates

膠凝體為SDS-PAGE 做準備
準備1X 連續緩衝
添加50 機器語言beta □基乙醇來950 機器語言範例緩衝(為1 機器語言) 。(只如果您未前添加beta □基乙醇到範例緩衝)
添加範例緩衝來各個範例(預先決定多少範例您能裝載每井- BioRad 梳子可能稀薄保留關於30uL 。大梳子裝accomate 於罐中由50uL 決定) 。
漩渦範例簡要。
戳一個�&洞在各支管裡蓋帽(防止頂層流行當煮沸)
煮沸在熱化block/water 浴在(95.C) 5 分鐘(低溫被顯示防止未指明的蛋白質彙總)

在煮沸蛋白質範例以後- 裝載和運行中SDS-PAGE 膠凝體

分離範例為1 分鐘在高速。
裝載範例入各個運輸路線。
裝載兆瓦(分子量梯子) 參考(您可以要
運行膠凝體在100V (100V 通過堆積膠凝體, 電壓可能被增加由200V 決定當運行在分離膠凝體以大量連續緩衝)

蛋白質範例調用到膜

準備1X 調用緩衝
浸泡和震動膠凝體在調用緩衝15 分鐘
浸泡硝化纖維素膜(或PVDF) 並且濾紙(額外厚實) 幾分鐘。
安置三明治在調用電池:

額外厚實的濾紙結算
膜
膠凝體
額外厚實的濾紙黑色

電調用: 35V overnite 或90V 1 個小時根據您的蛋白質或您的耐心的範圍!

西部弄髒的協議或Immunoblotting

準備1X TBST 從儲蓄解決方法。
準備阻攔緩衝(3% 遲鈍的清液白蛋白或5% 弄髒級別牛奶(Blotto) 在TBST) 。(您可以想要嘗試幾個不同的阻攔的次和情況) 。
洗膜在1X TBST 以震動10 分鐘。
塊在室溫1 個小時以阻攔緩衝(震動或圓板轉器)
孵化您的膜(PVDF 或硝化纖維素) 與主要1. Ab 抗體隔夜(為困難弄髒適應蛋白質的ie phosphorylation) 或1 時數為(容易的條件譬如總蛋白含量) 在4.C (overnite) 或室溫(1 時數孵出唯一) 用薩冉樹脂換行(柔和震動) 報道。您能使用塑料木盆從美元存儲為這(使用這些只為弄髒!) 或用途吸移管配件箱底層。稀釋為主要抗體是大約1:1000 。參見製造商的指令。
洗滌以1X TBST 3 X 15 分鐘
孵化您的膜(PVDF 或硝化纖維素) 與附屬抗體, 2. Ab 30 – 45 分鐘或(1 時數- 為困難的弄髒的情況) 在室溫。稀釋為附屬抗體通常是1:10,000 或更高。(ie 1uL 附屬在TBST 10mL 每膜) 參見製造商的指令。您可以想要添加您的抗體來阻攔解決方法減少未指明的捆綁特別是如果您得到了強背景在您的第一個實驗。
洗滌與TBST 4-5 X 10 分鐘。這是最重要的洗滌的步驟。
ECL (5min)
曝光對影片。通常西部汙點的曝光時間是大約10-30 秒。長期(5-10 分鐘) 為phosphorylation 。如果您有一個真正地微弱的信號, 或您需要裝載更多蛋白質或設法增加曝光時間(30 分鐘- 您能設法把它留在在casette 更加長式) 。
保留您的膜! 您能保留您的膜在TBST 1X 在冰箱有一陣子。您可能需要它為以下原因: 1) 檢查裝載(紙審核人也許請求總蛋白含量或裝載標準譬如肌動蛋白) 。並且, 您能首字母探查為磷蛋白質和然後剝離和reprobe 為總蛋白含量。