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裝備以他的五感覺, 人工探索宇宙在他附近和叫冒險科學。~Edwin Powell Hubble, Science 1954 年的本質
1 。試劑: 檢驗試劑由溶化做100 Coomassie 毫克藍色G250 在50 機器語言95% 對氨基苯甲酸二。解決方法與100 機器語言85% 磷酸被混合和然後被彌補對1 升與蒸餾水。試劑應該被過濾通過Whatman 第1 濾紙和然後被存儲在一個琥珀色的瓶在室溫。它是穩定幾個星期。但是, 在這時間期間染料也許沉澱從解決方法和因此被存儲的試劑應該被過濾在用途之前。
2 。蛋白質標準。遲鈍 γ- 球蛋白以1 mg/mL 的濃度(100 .g/mL 為microassay) 在蒸餾水裡被使用作為儲蓄解決方法。這應該被存儲凍結在 –20oC 。因為堅實蛋白質濕氣含量也許變化在存貯期間, 蛋白質的精確濃度在標準解法應該是堅定的從其absorbance 在280 毫微米。一個1 個mg/mL 解決方法的absorbance γ- 球蛋白, 在1 cm 輕的路�&, 是1.35 。對應的值為二個替代蛋白質標準、遲鈍的清液白蛋白和卵白蛋白, 是0.66 和0.75, 各自地。
3 。塑料和玻璃器皿被使用在檢驗應該任意是absolutely 乾淨和洗滌劑。石英(硅土) 分光光度表小試管不應該被使用, 因為染料束縛對這種物料。染料區域跟蹤對玻璃器皿或塑料可能被漂洗去除以甲醇或洗滌劑解決方法。
1 。吸取在10 之間和100 蛋白質.g 在100 .L 總數量入試管。如果近似範例濃度是未知的, 檢驗稀釋(1, 1:10, 1:100, 1:1000 的) 範圍。準備各個範例重複項。
2 。為定標曲線, 吸取10 的複製數量, 20, 40, 60, 80, 和100 1 mg/mL .L γ- 球蛋白標準解法入試管, 和做每個100 .L 與蒸餾水。吸取100 蒸餾水.L 入一支進一步管提供試劑空白。
3 。添加5 機器語言蛋白質試劑來各支管和混合很好由反向或輕拍vortexmixing 。避免起泡沫, 將導致粗劣的增殖率。
4 。措施範例和標準的A595 反對試劑空白在2 分鐘和1 h 之間在混合以後。100 .g 標準應該給A595 值的大約0.4 。標準曲線不線性, 並且精確absorbance 變化根據檢驗試劑的年齡。結果, 它重要修建一團定標曲線為各套檢驗。
Microassay 方法這份檢驗的表單對蛋白質是敏感的。結果, 它是有用的當相當數量未知的蛋白質被限制(參見也附註9) 。1. 吸取複製範例包含在1 之間和10 .g 在100 的一個總數量.L 入1.5 機器語言聚乙烯microfuge 管。如果近似範例濃度是未知的, 檢驗稀釋(1, 1:10, 1:100, 1:1000 的) 範圍。
2 。對定標曲線, 吸取10 的複製數量, 20, 40, 60, 80, 和100 100 .g/mL .L γ- 球蛋白標準解法入microfuge 管, 和對100 調整數量.L 用水。吸取100 蒸餾水.L 入一支管為試劑空白。
3 。添加1 機器語言蛋白質試劑來各支管和柔和地, 但周到地混合。
4 。評定各個範例absorbance 在2 和60 分鐘之間在蛋白質試劑的添加以後。範例的A595 值包含10 .g γ- 球蛋白是0.45 。
參見: 布雷得佛蛋白質檢驗
修改從協議由Nicholas J. Kruger 。
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