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那種理論是不值得的。這不是甚而錯誤的! ~Wolfgang Pauli
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您有達到成功PCR 的問題嗎? 許多系數可能影響您的PCR 您的通話結果譬如: 金屬離子輔助因素、基體和基體類似物、緩衝和鹽和Cosolvents 。 並且熱量循環的對價: PCR 船、溫度和時間優化, PCR 放大作用循環、Enzyme/Target 和熱起動。
一個重要輔助因素為DNA polymerase 在PCR 是鎂氯化物。 其濃度必須被優選為每個primer:template 系統。回應的許多要素束縛鎂離子, 包括底漆、模板、PCR 產品和dNTPs 。主要1:1 蟲膠黏合劑為鎂離子是dNTPs 的高濃度在回應。由於它是必要為自由鎂離子擔當酵素輔助因素在PCR, 總鎂離子濃度必須超出總dNTP 濃度。典型地, 開始優化進程, 1.5 毫米鎂氯化物被添加來PCR 在0.8 毫米總dNTPs 面前。這留下大約0.7 毫米自由鎂為DNA polymerase 。總之, 鎂離子應該變化在濃度系列從1.5–4.0 毫米在0.5 毫米步驟。
DNA polymerases 非常高效率地合併dNTPs 。 他們能還合併被修改的基體, 當他們被使用作為補充要素在PCR 。基體實例被使用為DNA polymerase 是: Digoxigenin-dUTP 、生物素11 dUTP 、dUTP 、c7deaza-dGTP, 和fluorescently 被標記的dNTPs 。為常規PCR, dNTPs 遺骸的濃度的被平衡在等摩爾比率, 即, 各 μdNTP. 並且注意那的200 M, 偏差從這些標準推薦標準也許是有利的在某些amplications 。例如, 當一個特定目標的任意mutagenesis 渴望, 失衡的dNTP 濃度促進高度misincorporations 由DNA polymerase 。
根據DNA polymerase 使用了優選的PCR 緩衝濃度, 鹽含量, 並且酸鹼度應該相應地被採摘對DNA polymerase 。PCR 緩衝為Taq DNA polymerase 包括50 毫米KCl 和10 毫米Tris-HCl, 酸鹼度8.3, 在室溫。這緩衝提供離子強度和緩衝能力需要在回應期間。它重要注意到, 鹽含量影響primer:template 套樓公寓的Tm, 並且因此燜火溫度。
另外PCR Cosolvents 使用增加PCR 放大作用產量、效力, 和特異性。這些cosolvents 可能是有利在一些放大作用, 和不利的在其它放大作用。它不可能預言哪附加將是有用的為各所primer:template 套樓公寓和因此cosolvent 必須經驗主義地被測試為各個組合。
PCR 必須執行在是與低數量酵素和核酸兼容並且有好熱量調用特性的船裡。通常, 聚丙烯被使用為PCR 船並且常規, 厚壁microcentrifuge 管被選擇為許多熱量cycler 系統。PCR 執行在一10 100 升–回應 μ縮放比例和經常要求evaporation/condensation 進程的預防在閉合的回應管在熱量循環期間。一塊礦物油重�&或蠟層為這個目的服務。最近, 0.2 機器語言薄壁船被優選了為PCR 進程並且使用激昂的蓋子在管被拿著在範例塊之內的oil-free 熱量cyclers 被設計了。
它是必要的反應混合物到達變性、燜火, 和擴展名溫度在各個熱量循環。如果不足的佔用時間被指定在任一個溫度, 範例的溫度不�&被平均與那範例塊。一些熱量cycler 設計暫掛間隔根據塊溫度的時間, 但是其他人根據佔用時間被預言的範例溫度。如果一支常規厚壁管被使用在cycler 由塊溫度控制, 60-s 佔用時間是充足的為平衡。額外時刻也許被推薦在(72.C) 擴展名步驟為更加長式的PCR 產品。使用一支薄壁0.2 機器語言管在cycler 由被預言的範例溫度控制, 只15 s 必需。使用現有的協議或對發展協議至於使用在多個實驗室, 它非常重要選擇佔用時間根據cycler 設計和管壁厚度。
PCR 放大作用循環的數量應該被優選談到目標DNA 的開始的濃度。它建議, 從40– 45 個循環放大50 個目標分子, 和25–30 個循環放大3 × 105 個分子對同樣濃度。這非比率性由所謂的高原作用造成, 在產品累計的指數費率的減少發生在PCR 的延遲階段。這也許由反應劑造成(dNTPs, 酵素的) 退化; 反應劑取盡(底漆, dNTPs); 最後產物禁止(焦磷酸形成); 競爭為反應劑由未指明的產品; 或競爭為底漆束縛由reannealing 被集中的(10 毫微米) 產品。它通常是適當運行循環的最小數字必要看渴望的特定產品, 因為不需要的未指明的產品將干涉如果循環的數量過份。
在一個標準整除數Taq DNA polymerase 被使用為一100μ升回應, 有大約1010 個分子。各個PCR 範例應該被評估為它包含或也許包含目標複製的數量。例如, 1 ng lambda DNA 包含1.8 × 107 複製。為低輸入複製編號PCR, 酵素成為限制並且它也許是必要遞增給擴展名進程更多時間。熱量cyclers 可能可靠地執行這個自動細分市場擴展名程式為了最大化PCR 產量。
所有上述優化並且適用於被設計, 從一開始, 以一個熱起動方法的PCR 。經常, 熱起動可能成功被合併早先優化PCR 沒有更改回應條件。但是, 它通常支付reoptimize 在添加熱起動以後。優化經常是一個平衡在生產同樣多產品儘可能和overproducing 未指明, 背景放大作用之間。由於熱起動很大地減少背景放大作用, 上部克制被上升在條件譬如酵素含量、週期編號, 和金屬離子輔助因素濃度。高被定調了沒有熱起動的敏感PCRs 也許失敗當熱起動被添加。這可能由輕微的延遲造成在早期循環由混合或酵素起動造成。PCR 可能通常被恢復, 經常以在特定產品的堅固增量, 被簡單增加限制參數或試劑。另外, 有優化特定對各個熱起動方法。混合或酵素起動可能由PCR 數量、緩衝構成和酸鹼度, cosolvents, 循環的情況影響, 等等。特定產品’s 文件, 經常產品插入, 應該被咨詢對於資訊關於這些對價。
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