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情況是大家相信的一個簡單語句。它是無辜的, 除非查找有罪。假說是沒人想要相信的一個新穎的建議。它是有罪的, 直到查找有效。~Edward 出納員
版權 © 分子崗位2006 年
當您想要描繪基因或蛋白質利益, 您必須首先學習其功能。在這個分子時代, 獲得您的基因DNA 利益不是困難的。
表達DNA 作為蛋白質, ie. 再組合蛋白質, 你可能容易地然後進行功能研究使用再組合被淨化的蛋白質。
一旦您有被淨化的蛋白質您能�&辦:
有二個主系統為再組合蛋白質表達式。一旦您得到您的DNA 被克隆, 您必須決定何處您想要放大您的蛋白質。這將是或一個prokaryotic (細菌) 或eukaryotic (通常酵母或哺乳細胞) 系統。您的系統選擇將決定哪傳染媒介您將需要克隆您的DNA 入儘管有起作用在E.Coli 的不同的促進者並且其他人服務最好以酵母或哺乳動物的系統。
如此蛋白質的表達式系統將您使用?
Prokaryotic 再組合蛋白質表達式系統有幾好處。這些包括文化舒適, 和非常您不�&必須長期等待得到蛋白質從細菌系統的迅速電池增長含義一旦您克隆您的DNA 。表達式可能容易地導致在細菌蛋白質表達式系統使用IPTG 。並且, 洗淨是相當簡單在prokaryotic 表達式系統並且有多血症商業工具箱可利用為再組合蛋白質表達式。
另一方面, 如果您需要使用您的蛋白質為功能或enzymatic 研究prokaryotic 系統是問題當多數蛋白質變得不能溶解在包括機體並且非常難收回作為功能蛋白質。此外, 多數如果沒有所有過帳平移修改由細菌和因此您的蛋白質利益不添加不能是工作。Enzymatic 研究也許因而無效。
Eukaryotic 基因真正地在家不是 “” 在prokaryotic 電池裡, 既使當他們被表達在prokaryotic 傳染媒介的控制之下。 一個原因是, E. 桿菌電池認可被克隆的eukaryotic 基因蛋白質產品作為局外人和頻繁地毀壞他們。 另是, prokaryotes 不執行作為真核的這种同樣posttranslational 修改。 例如, 普通�&被耦合對糖在一個eukaryotic 電池的蛋白質將被表達作為光禿的蛋白質何時克隆用細菌。 這可能影響蛋白質’s 活動或穩定, 或至少其對抗體的回應。 一個更加嚴肅的問題是, 一個細菌電池的內部像有助於不是eukaryotic 蛋白質適當的可摺�&作為一個eukaryotic 電池的內部。 頻繁地, 結果不正當地被摺�&, 被克隆的基因非活動產品。
Eukaryotic 系統為蛋白質表達式有:
所有這些系統是巨大eukaryotic 系統為再組合蛋白質表達式。
eukaryotic 蛋白質表達式系統好處包括情況您能得到非常高水平表達式。蛋白質容易淨化使用是包括的入傳染媒介包括他的特殊貨簽, Myc 和其它貨簽。
您能甚而採購藏匿您的蛋白質入媒體的質粒。所以您能繼續生長您的系統和收集媒體沒有溶解您的電池。沒有包括機體憂慮並且您的蛋白質有原封過帳平移修改。這些是重要的如果您學習蛋白質並且/或者蛋白質蛋白質交往的功能。
eukaryotic 蛋白質表達式系統不利包括情況eukaryotic 電池增長慢比prokaryotic 電池。
表達式傳染媒介的主函數將通常產生基因的產品, 更多產品更好。 所以, 表達式傳染媒介普通被裝備以非常堅強的促進者; 理論基礎是更多mRNA 被生產, 更多蛋白質產品將被做。
一個這樣堅強的促進者是trp (色氨酸operon) 促進者。 它形成為幾表達式傳染媒介的基本類型, 包括ptrpL1 。 它安排一個trp promoter/operator 區域, 被核糖體束縛位置跟隨, 和可能被使用直接地作為表達式傳染媒介由插入一個外部基因入ClaI 站點。替代, trp 控制區域可能由 “剪切” 它與ClaI 和HindIII 和插入使便攜式它在基因前面用其它傳染媒介被表達
它通常是有利保留一個被克隆的基因represed 直到我們準備好表達它。 一個原因是, eukaryotic 蛋白質被生產在細菌可能大量地是含毒物。 既使這些蛋白質實際上不是含毒物, 他們能加強auch 了不起的級別, 他們干涉細菌增長。 無論如何, 如果被克隆的基因被允許保留經常打開, 細菌負擔基因從未�&成長為足夠巨大濃度導致蛋白質產品的意味深長的數量。 解決方法將保持被克隆的基因由安置關閉它順流可能讓厭惡的一個可誘導促進者。
紫膠促進者是可誘導的某種程度上, 據推測殘餘直到由綜合inducer isopropylthiogalactoside 刺激(IPTG) 。 但是, 抑制由紫膠鎮壓者造成未完成, 並且被克隆的基因的某一表達式將被觀察在沒有inducer 時。 單程在這個問題附近將用運載其自己的lacI 基因的質粒或phagemid 表達我們的基因, 如同pBS 。 超額鎮壓者生產了由這樣傳染媒介保留我們的被克隆的基因被關閉直到我們準備好導致它與IPTG 。
其它方法是使用一個緊緊受控制促進者作為 λ 噬菌的促進者PL 。表達式傳染媒介以這個promoter/operator 系統被克隆入寄主細胞負擔一個溫度敏感 λ 鎮壓者基因(c1857) 。 只要我們保持溫度這些電池相對地低(32.C), 鎮壓者起作用, 並且表達式不發生。 但是, 當我們提高溫度對nonpermissive 級別(42ºC), 溫度敏感鎮壓者可能不再起作用並且被克隆的基因導致。
當多數表達式傳染媒介運行, 他們生產融合蛋白質。 這也許起初似乎不利因為被插入的基因的自然產品不被製作。 但是, 額外氨基酸在融合蛋白質可能是偉大的幫助在淨化蛋白質產品。
考慮oligo 組氨酸表達式傳染媒介, 其中之一有商標pTrcHis 。 這些有一個短的順序upstream.of 輸入舒展六組氨酸的多個克隆站點。 因而, 蛋白質用這樣傳染媒介被表達將是融合蛋白質與六組氨酸在其氨基末端。 為什麼我們�&想附有六組氨酸我們的蛋白質? Oligo 組氨酸地區像這樣有高親合力為金屬像鎳, 因此我們能淨化有這樣地區使用鎳親合力色譜法的蛋白質。 這個方法秀麗是其簡單和速度。 在細菌做了融合蛋白質之後, 我們簡單溶解他們, 添加srude 細菌解壓縮來鎳親合力列, 洗滌所有未捆綁的蛋白質, 那麼發行融合蛋白質與組氨酸或組氨酸模式叫的咪唑。 這個程式允許我們重要收穫純淨的融合在只一個步驟。 這是可能的因為非常少數如果任何自然蛋白質有oligo 組氨酸地區, 因此我們的融合蛋白質重要是唯一一個束縛對列。
我們若想要我們protein-free oligo 組氨酸貨簽呢?
這些傳染媒介的設計員周道地提供了一個方式去除它。 在多個克隆站點之前, 有編制程式區域為舒展氨基酸由蛋白水解的酵素enterokinase 認可。 如此我們能使用enterokinase 劈開融合蛋白質入二份: oligo 組氨酸貨簽和我們要的蛋白質。站點由enterokinase 認可是非常罕見的, 並且機�&它存在在我們的蛋白質裡是無意義的。 因而, 我們的蛋白質不應該被砍當我們去除其oligo 組氨酸貨簽。 如果我們要, 我們能運行enterokinase 被劈開的蛋白質通過鎳列更加分離oligo-hisitidine 片段從蛋白質利益。
λ 噬菌並且起基本類型作用對於表達式傳染媒介; 你特定被設計為這個目的是 λgt11 。 這噬菌包含紫膠控制區域被lacZ 基因跟隨。 克隆站點位於在lacZ 基因之內, 因此基因的產品被插入入這傳染媒介將是融合蛋白質與B galactosidase 領導。
表達式傳染媒介 λgt11 成為了一個普遍的通信工具為做和篩選DNA 圖書館。 λgt11 允許我們篩選一個組克隆直接地為正確的蛋白質的表達式。 主要配料必需為這個程式是DNA 圖書館在 λgt11 和抗血清被指揮反對蛋白質利益。
我們鍍我們的 λ 噬菌與各種各樣的DNA 插入和弄髒蛋白質被各克隆發行技術支持譬如硝化纖維素。 一旦我們從各塊匾調用了蛋白質到硝化纖維素, 我們探查與我們的抗血清。 其次, 我們尋找抗體一定對蛋白質從一塊特殊匾, 使用被標記的蛋白質A
從Staphylococcus-aureus 。 這蛋白質緊緊束縛對抗體和標記對應的地點在硝化纖維素。 我們檢測這個標籤由自動射線照像術或由phosphorimaging, 然後去我們的主要板材和採摘對應的匾。 注意我們檢測融合蛋白質, 不是蛋白質利益。 此外, 它不事關如果我們克隆了一整體DNA 。 我們的抗血清是將起反應以幾我們的蛋白質的不同的部份抗體的混合物, 那麼甚而一個部分基因將做, 只要其編制程式區域被克隆在取向和讀取框架和B galactosidase 編制程式區域一樣。
為快速再組合蛋白質表達式覆核看見:
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