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06-12-2008, 下午10:51
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 Re PCR 麻煩 大家好。 我設法放大基因, 和同時介紹點變化, 啟用消化與特定酵素利益, 以最終目標克隆我的基因入特定質粒。 因為我需要的點變化是5 (不能查找一個更加適當的站點設計底漆, 我需要停留在框架與目標質粒的ATG) 我設計二轉接底漆的原因, 一以3 個點變化和第二（個）符合第一轉接, 和介紹殘餘的二個變化。我使用同樣反向底漆配對兩我轉接。 第一成對(轉接底漆A 和反向底漆) 工作的正義罰款, 我得到了我要的產品, 容易地和相當清楚(在優化配置文件以後我得到了只一個範圍, 正確一個) 。但是, 在re PCR 期間使用早先收效的產品作為模板, 和使用第二成對底漆(轉接底漆B 和反向底漆), 我得到2 範圍、他們兩個極端強烈和他們兩個相當低比期待的一個。以氯化鎂的更高的濃度, 我並且得到了第三個範圍(渴望的一個) 但它是極端微弱的。我無法是肯定的如果這並且是沒有起反應與底漆... 的某一模板DNA 的部份 金額模板為rePCR 是1ul 。 燜火溫度為兩成對底漆是64C, 但我有去的66, 和仍然, 第一個成對工作, 其次不。 並且, 快速附註: 介紹變化由供選擇方式或選擇另外酵素為克隆程式不是選項。 請, 所有線索和建議是主要受歡迎的。 抱歉為長式過帳, 和thanx 事先。        |
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06-16-2008, 下午02:17
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| Re: Re PCR 麻煩 我是正確地讀, 您使用了您的第一個PCR 產品1 uL 作為模板為您的第二種回應? 這似乎像可怕的批次DNA 對我。 您怎麼淨化了您的DNA 在二個PCR 步驟之間? (根據痣或克) 您添加多少DNA 來您的第二種PCR 回應嗎? 您運行多少個循環為二種回應? 我認識您您無法使用任何交錯法的言, 但是它也許值得直言結束克隆第一產品驗證它有正確變化在進行之前。 它也許還值得設計其它反向底漆在您想要放大為第一PCR 回應的區域之外, 避免您可以有嘗試re 頭等與同樣底漆的問題。 |
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06-17-2008, 下午11:02
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| Re: Re PCR 麻煩 報價:
很好, 我實際上沒有淨化第一PCR 產品在進行到第二個之前, 導致我的範圍是非常清楚, 並且我沒有其它產品, 或汙跡。但是, 我計劃再嘗試和提取模板為第二PCR 通過膠凝體提取, 如果一個non-visible 範圍被放大。我使用為第二PCR 的模板是大約10-30 ng 。我運行40 個循環。 不幸地, 我沒有時間再設計和命令底漆, 我必須存在我的文憑工作在9月的原因, 並且我仍然有第二個克隆零件(與標誌基因) 並且整體基因(標誌首字母基因) 必須然後被克隆入指定的表達式傳染媒介, 做大規模隔離和然後去in-vivo 。我的計劃是極端緊的!!! 這缺乏時間, 除粗劣資助項目之外導致我的無能追求替代方法。想像, 我沒有甚而能力使用工具箱, 我做所有我的隔離老被塑造的方式, 極端費時。 無論如何, 謝謝您的回復, 我並且將設法稀釋我的第一個產品1:10 和設法使用這作為模板, 如同oBWhat 建議(謝謝太), 並且看見怎麼它是... |
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