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12-05-2006, 下午08:44
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 Re: PCR 和Topo 克隆 報價:
零的直言的TOPO PCR 克隆工具箱 (Invitrogen 生活技術) 這個工具箱特定被設計克隆直言結束PCR 產品由耐高溫的校對的polymerases 生成譬如Pfu 。 1. PCR 設置PCR 回應: 添加ddH2.O 來最終數量來49 機器語言 DNA 模板1-5 機器語言 10 X 回應緩衝5.0 機器語言 dNTPs 5.0 機器語言 底漆1 2.0 機器語言 底漆2 2.0 機器語言 DMSO 3.0 機器語言 添加ddH2.O 來最終數量來49 機器語言 熱起動 添加Pfu 來回應1.0 機器語言 設置thermocyler 程式: 熱起動 變性944A.C 30 秒數 燜火554A.C 30 秒數 擴展名724A.C 90 秒數(1 min/kb) 25-30 個循環 在循環以後, 孵化回應在724A.C 另外7 分鐘 冷卻回應對44A.C, 準備好克隆 2. 克隆 這時您應該有您的直言結束PCR 產品準備好TOPO 克隆並且轉換入一射擊了TOPO10 電池。它對轉換是非常重要儘快進行從TOPO 克隆回應保證最高的克隆和轉換效率 克隆回應 設置以下5 機器語言TOPO 克隆回應 新鮮的PCR 產品0.5 – 3.0 機器語言 不�&的ddH2.O 添加來4 機器語言的最終數量 PCR 直言的TOPO 傳染媒介1 機器語言 最終數量5 機器語言 1. gentaly 混合得和孵化5 分鐘在室溫(254A.C) 。為最好結果, don’t 動身去超過5 分鐘或轉換效率將減少。 2. 簡要離心機和安排管在冰。回應也許被留下在冰30 分鐘。我們推薦, 您進行對立即一射擊了轉換回應。 3. 轉換 一射擊了轉換回應 1. 添加~2 機器語言TOPO 克隆回應入小瓶一射擊了電池和柔和地混合。 2. 孵化在冰30 分鐘。 3. 加熱震動電池30 秒在424A.C 沒有震動。 4. 調用立即管到冰和孵化2 分鐘。 5. 添加250 機器語言室溫SOC 或鎊媒體。 6. 緊緊加蓋管和水平地震動管在374A.C 1 個小時。安置在冰。 7. 傳播轉換在a prewarmed 鎊板材與適當的抗生素和隔夜孵化在374A.C 。 8. 帶走殖民地為分析。 4. 對正克隆的分析 1. 作為殖民地和隔夜開化他們在鎊媒體包含50 mg/ml 康納徽素或100mg/ml Ampicillin 。 2. 隔絕質粒DNA 運用Promega 微型prep 方法。(參見協議) 3. 分析質粒由限制分析(EcoR I) 。檢查由微型膠凝體。 4. 為有正確的插入的質粒, 繼續克隆opa 基因入表達式傳染媒介。 5. 消化質粒和寵物與NdeI/BamHI: 消化質粒和pMAL c-II 與BamHI 唯一(限制酵素被使用應該是不同的為不同的建築) 6. 表達式傳染媒介的Dephosphorylation 30 分鐘。 7. 運行一個預備膠凝體到分開的被消化的DNA 片段。 8. 剪切感興趣的DNA 範圍和從膠凝體提取DNA 由GeneClean Kit 。(參見GeneClean 協議) 9. 設置結紮術回應。 結紮術緩衝1 機器語言 連接□1 機器語言 表達式傳染媒介x 機器語言 基因DNA y 機器語言 總數量10 機器語言 孵化結紮術回應在44A.C 為隔夜        |
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