PCR "克隆" 這�&是可能的嗎?

Ammie · #1 (**permalink**) 09-17-2007, 上午08:51

這(以下) 理論上�&有效, 是嗎? (不那麼體驗...)

第一步:
我有質粒與插入。我想要改變二nucleotides 。我定購�&底漆, 第一底漆(A 今後) 是設計從第一nt 的面積與突變體nt 在底漆中間。第二底漆(B 反向) 是從第二個面積與第二突變體nt 在中間om 底漆。當一起使用在PCR 他們給是插入的部份與渴望的變化的nucleotides 的一個產品。

第三底漆(C- 撤消) 是補全對A, 和第�&底漆(D 轉接) 是補全對B 。當他們一起被使用他們給插入的剩餘的一個PCR 產品與質粒順序一起。

第二個步驟:
我使用兩個PCR 產品的很多原材料和在相等的相當數量copies/ends 和添加他們與polymerase (pfu 超可能), 適當的緩衝一起, 水和dNTPs. 他們現在將鍛煉對eachother, 因為他們重�&在各個末端並且他們是瘦長的給一個圈子與二個裂口(在不同的安排) 。放大作用不發生。

(我做一張小的照片說明它(未被准許有它更大))

比我能使用這個混合物為transfection, 並且"被綁紮的" 產品給殖民地...

如此, 您認為什麼?

danfive · #2 (**permalink**) 09-17-2007, 下午04:16

記得綜合oligos (底漆) 缺乏5' 終端磷酸鹽組被要求為結紮術。

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