11-15-2006, 上午10:40
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膠凝體電泳法麻煩 親愛所有, 在我的第一試算以電泳法, 我依照被推薦使用了TAE 緩衝在Maniatis, 2001 包括40mM Tris 醋酸鹽, 酸鹼度7.0 和0.5M EDTA pH8.0. 這試算我沒有獲得任何範圍包括DNA 梯子(Fermentas) 。 下幾試算, 我依照由Kado 和劉推薦設法使用TE 緩衝根據文件由包括0.04M Tris 醋酸鹽的Mickel, 競技場和Bauer (有形資產和膠凝體R12 被派生的質粒DNAs, 核酸研究電泳法工作情況), 和2mM EDTA, 酸鹼度8.1 。最新的試算, 我有微弱的範圍為質粒我的範例並且更強的範圍為控制(pUC19), 然而, 梯子沒有顯示根本雖然我裝載了梯子在井在兩個膠凝體的末端。為什麼它是如此? 什麼能是錯誤的? 其它問題比另外一半是, 在紫外照明, 膠凝體(負末端的一半之下與範例井) 似乎明亮的。有清楚的差額在兩個末端之間某處在膠凝體中間。為什麼它是如此? 感謝alot 。         |
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今天
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11-15-2006, 下午04:35
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 Re: 膠凝體電泳法麻煩 我�&做的第一事�&是檢查您弄髒的協議。您是使用的Ethidium 溴化物或其他嗎? 您添加您的汙點來膠凝體, 來範例,
或弄髒post-run 嗎? 如果使用EtBr 和添加它來膠凝體, 您將看見那個一半被弄髒的一半沒有膠凝體仿造因為EtBr 移居往負極(您的範例井是) 膠凝體的末端。您能修理這由弄髒post-run 或由destaining 膠凝體(洗滌在水或緩衝在一個鼓動者5-10 分鐘在運行以後) 。 如果這不是實際情形, 您應該檢查電燈泡在您紫外transilluminator 看如果你燒壞。這將導致黑暗的地區在transilluminator 。 您形象化由眼睛或使用某一排序照相機(人造偏光板或CCD)? 您需要 更大量DNA 形象化由眼睛比與照相機。或許您的範例比您的梯子有更多DNA, 因此您能看範例和不是梯子嗎? 我驚奇, 您沒有任何人在以前進行了電泳法可能幫助您解決困難的您的實驗室。某人可能確切地觀看什麼您做□是巨大幫助在推測何處您變錯誤。 |
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11-16-2006, 下午06:39
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| Re: 膠凝體電泳法麻煩 如果您得以進入對照相機的, 我�&建議嘗試一個更久的曝光時間看如果您能看任何東西根本在您的膠凝體。 如果您有一個高螢光背景, 嘗試destaining 膠凝體因此您能看您的範圍更好。 嘗試一個全新的整除數梯子-- 這應該是一個巨大正控制因為您確切地知道多少DNA 您添加, 您知道它是乾淨並且什麼它應該看起來像。如果您使用一支更舊的管, 您能有DNAse 汙穢或其他mucking 範例。 |
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