09-06-2006, 下午08:00
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 Monoclonal 抗體的生產- 技術在滑鼠 免疫學技術 做Monoclonal 抗體 簡介 Monoclonal 抗體是偉大的! 為什麼? 特異性! 每一個認可只抗原結構的一個站點。為什麼? 不朽! 質量文化可能被生成從唯一克隆。 滑鼠小! 他們要求較少抗原比兔子得到抗體回應。抗原遊遍循環系統。血液開水道通過B 淋巴細胞電池認可外部機體和生產抗體的脾臟。 脾臟電池, 然而, 無法單獨生存在組織培養基。骨髓瘤電池能! 為什麼不熔化他們? 我們能選擇為被熔化的電池由使用帽子(hypoxanthine 、aminopterin, thymidine) 被補充的媒體。突變體骨髓瘤電池線路SP2/0 無法生存在帽子媒體因為它缺乏HGPRT 。aminopterin 在帽子補充條款阻攔DNA 綜合。酵素HGPRT 可能克服這個塊。脾臟電池有HGPRT 。熔化脾臟並且SP2/0 電池和您將找到倖存者在帽子組織培養基。 注: 記住, 不�&的技術! 洗滌yo ' 手。 如果您傾吐(您應該真正地吸取) 不溢出! 汙穢發生由於溢出在瓶和管外面。對氨基苯甲酸二和火焰當您感到偏執。 為您自己的安全性, 穿戴手套當解剖。 使用disPo 產品避免有洗滌劑殘滓的問題在被洗滌的玻璃器皿。 用品: BALB/c 母滑鼠為免役 一塊滑鼠/飼養者層 disPo 吸取- 10 機器語言和25 機器語言 組織培養瓶(5/飼養者層) 24 好的組織文化板材(大約12 每融合) 3 被真空加熱的套鑷子和剪刀 1 個被真空加熱的屏幕為脾臟電池分散作用 5cc 注射器(柱塞被使用分散電池在屏幕) 1.cc 注射器 18g & 25g (1/2 英寸) 針 100 塊毫米組織文化板材 15 & 50 機器語言不�&的圓錐形管 * 看見附有為詳細資料在定貨 免役 刪去蛋白質範圍從polyacrylamide 膠凝體。 Coomassie 汙點小時& destain (10% 乙酸, 45% 甲醇) 儘快, 剪切範圍當他們是可識別的限制時間膠凝體是在酸裡。沖洗與PBSa & 刪去了範圍。蛋白質可能被存儲與小量的PBSa 在-20 冷凍機。 使第一射入蛋白質在1:1 比率與Freund 的完全或TiterMax 。 1. 使蛋白質均勻與小量的PBSa 因此蛋白質不得到太厚實。保留蛋白質寒冷當均勻。 2. 如果使用Freund 的, 混合死的細菌在瓶。把Freund 引入的注射器和強制它入一個小燒杯包含您的蛋白質範例。混合Freund 的和您的蛋白質直到它承擔白色泡沫似的一貫性。您可以必須更換針和注射器因為Freund 的起反應與塑料。 即注射6 個滑鼠以emlc 和rmlc 每個, 我運行一12% 膠凝體, 刪去了範圍, 均勻蛋白質和與Freund 的450ul 被結合各個蛋白質範例。這給我少許600ul 各個範例注射。 3. 注射。參見動物護養指南為更加進一步的指令。 注: � 注射100ul 每滑鼠。 � 您的範例必須被集中但不那麼濃厚, 您無法得到它通過一1/2 英寸, 25g 針。 � 不�&是重要為滑鼠的健康! 二個星期以後, 做第二射入蛋白質與Freund 的未完成輔藥或TiterMax 。 二個星期以後, 做測試滲�&。如果負的, 做其它提高與Freund 的未完成輔藥或TiterMax 。 五個日在融合之前, 做蛋白質最終提高沒有Freund 的。 測試流血 標記滑鼠的尾巴。 適用於油膏尾巴(面積的3/4 英寸, 從基礎往要訣) 。 使用極端鋒利的刀片做片式(EM 刀片) 。小心不穿過尾巴只是使剪切足夠大畫大約2.5 heprinized 血絲管。 施加壓力盯梢創傷終止靈菌。 轉動在血液下以最大速度5 分鐘在microfuge 。 撤退和存儲清液在-20o 直到您能測試在汙點在1:100 或在1:50 。 準備為融合日 WED/THURS 解凍在SP2/0 之外板材, 分裂了一到3. (必須分裂在週末期間) 。需要10-12 100mm 板材在日誌階段為融合。 快速解凍管在37o 浴。投入入falcoln 管與溫暖的媒體10ml 。讓坐5 分鐘。轉動下來在低速。重新懸掛在10 機器語言和轉動。重新懸掛在30ml 和投入入3 塊板材。 THURS 運行膠凝體為最終提高。 星期五 做蛋白質最終提高沒有Freund 的或Titermax 。 星期一 準備飼養者層 TUES 做融合! 飼養者層日 收集 動物董事�ðanoled 和然後消炎了在紫外光之下 2 x 10 機器語言陪替式培養皿 被真空加熱的鑷子、剪刀, & 屏幕 5 機器語言注射器, 10 機器語言注射器, 18g 針 燒杯與95% 對氨基苯甲酸二 disPo 10 機器語言吸取 溫暖以下在37o 熱水鍋: � 50 機器語言整除數DMEM- 沒有附加 � 下列被添加了的500 機器語言瓶DMEM 二: 5 機器語言鈉丙酮酸鹽 5 機器語言L glutamine HAT(with 注射器, 泵浦5ml DMEM 入帽子瓶, 添加來DMEM) 5 機器語言anti-biotic/anti-mitotic (不要溫暖通過室臨時) 50 機器語言Hyclone 胎兒小牛清液 投入入5 x 50 機器語言圓錐形管(以後調用到5 個燒瓶為飼養者層) 。 � 設置不�&的解剖的器物。 � 得到正常un-immunized 滑鼠。 � 安置屏幕在板材裡以10 機器語言DMEM - 。 解剖 工作快速! (更慢的您是, 更加困難的它是工作與動物。並且, 您不要媒體冷卻。) � 犧牲滑鼠。對氨基苯甲酸二直到飽和。Pin 動物到位。 � 使用一套器物穿過皮膚, 針返回擋水板。對氨基苯甲酸二! � 使用其次設置器物對剪切通過腹膜。 � 使用第三設置拔出脾臟, 剪切結締組織。 更換器物非常重要避免汙穢。 洗滌電池 � 快速投入脾臟在盤以10 機器語言DMEM - 。和仔細地分散脾臟電池與一個5 機器語言注射器的柱塞反對屏幕。 � 留下結締組織在網格, 上上下下吸取和投入電池入15ml 圓錐形管。讓大大塊結算對管的底層2-3 分鐘。 � 調用上層清液到其它管帶來數量15 機器語言與更多DMEM- 給洗滌。轉動下來10 分鐘在170g 在臺式離心機。 � 仔細地, 吮上層清液與不�&的pasteur 吸取。再洗滌脾臟電池與10ml DMEM - 。 � 吮超級。Resusp 。在5ml DMEM -, 孵化10 min. 在37o 浴。傾吐DMEM+ 5x 50ml conicals 入tc 燒瓶。投入脾臟電池1ml 在各個燒瓶裡。 � 孵化o/n 在6% 二氧化碳37o 分庭。放置燒瓶在邊與蓋帽鬆開。 融合日 I. 收集免疫脾臟電池。 II. 收集SP2/0 電池。 III. 與飼養者層結合。 收集 � 所有同樣用品被使用為飼養者層在日前。 � 調用50% 釘入一支圓錐形管。 � 溫暖釘、洗滌媒體, 和殘餘的DMEM+ 在37o 熱水鍋。 補白消炎殘餘DMEM+ 媒體從被飼養者層昨天跟隨。飼養者層是可能堵塞補白。(確定您有媒體在容器在轉動在真空之前您能否則傷補白膜) 。 準備免疫脾臟電池 跟隨協議使用解剖滑鼠為飼養者層。 它重要使時間減到最小, 脾臟電池是或不是在動物或不是在孵養器。因此和根據多您快能解剖滑鼠, 您可以想要首先收集SP2/0 電池。 收集SP2/0 電池 Triterate 電池從10 塊板材和投入入2 x 50 機器語言圓錐形管。 旋轉在電池下。洗滌電池2x. 藥丸10 min. 在170g 。 射擊脾臟電池當triterating SP2/0 電池 resusp 脾臟電池, 洗滌, 藥丸當藥丸SP2/0 電池 resusp 脾臟電池, 洗滌, 藥丸當resusp 一個管在5ml, 調用 其它管, 洗滌, 藥丸 resusp 脾臟電池在10 機器語言, 計數, 當resusp SP2/0, 洗滌, 藥丸 讓坐10 分鐘在37o resusp 在20-30 機器語言, 計數 1 個x 108 個脾臟電池添加來5 x 107 SP2/0 電池 � 藥丸電池一起以更高的速度(在170 之間- 200g) 。 � 吮媒體 � 添加1.5 機器語言釘1 min. 在鼓動之下-- 這是融合!!! 攪動以要訣柔和地吸取混合在釘 � 等待90 秒, 柔和地攪動。 � 在下分鐘期間, 添加被溫暖的DMEM- 1ml 當攪動。 � 重複早先步驟。 � 添加8 機器語言DMEM- 5 分鐘。 � 等待10 分鐘。然後, 打亂電池由柔和地吸取5 次。 � 稀釋入不�&filterized DMEM+ 以飼養者層。 � 整除數2ml/ 很好在24 好的板材(~ 10-12 板材裡) � 孵化在6% 二氧化碳, 37o 分庭裡為一個星期。 � 哺養和孵化在~one 星期。 審查 一個星期在第一媒體哺養以後: 測試媒體轉動黃色的井。 撤退500ul & 對汙點小條的測試, 隔夜孵化。(不要忘記正控制包括滑鼠抗體- 使用滑鼠polyclonal 清液和一個標記。) 長大正井在更大的板材裡。 再實驗井和其對應的板材。 兩個應該是正。繼續分裂正板材和凍結下來(在10% DMSO) 和上升。Triterate 和稀釋電池從正入一塊96 口井板材在1 個電池的稀釋對~3 很好湧出。我們向唯一克隆求助! 調用電池在96 塊好的板材對24 好的板材和重測。 再通過稀釋直到所有井測試正並且您被說服您有一條monoclonal 電池線路。 最終, 嘗試和斷絕電池從10% FCS 到5% FCS, 和從帽子到HT 對unsupplemented 媒體。 IgG 的親合力洗淨使用G 小珠(Pharmacia) 緩衝: 0.1M NaPO4, 酸鹼度7.0 一價- 5.52g 在200 機器語言為0.2M 一價 二元- 8.52g 在300 機器語言為0.2M 二元 開始用二元解決方法和滴定量與一價直到酸鹼度7.0 被到達 用水稀釋1:1 至於使用 1.0M 乙酸- 0.1M 氨基乙酸緩衝, 酸鹼度3.0 30.12 機器語言乙酸 3.75 g 氨基乙酸 帶來給500 機器語言用水 協議 1. 平均列以幾個酸鹼度7.0 緩衝的數量。 2. 投入範例在列- 10 機器語言兔子清液為IgG 隔離或木瓜消化的整個數量- 採取膠凝體範例。(流速以1mL/4 分鐘) 3. 之外通過- 在木瓜文摘裡通過通過包含很好- 通過採取膠凝體範例。 4. 洗滌對草擬以酸鹼度7.0 緩衝(1-2 時數) 。 5. 洗脫以酸鹼度3.0 緩衝- 作為15-20 分鐘看某事。 6. 收集0.5 機器語言分數和中立化解決方法與1.0M Tris 對酸鹼度7.4 (用途指示符小條) - 採取膠凝體範例。Spec 分數查找峰頂。 7. 洗滌以酸鹼度3.0 緩衝15 分鐘和存儲在20% 對氨基苯甲酸二裡。 8. 隔夜滲析IgG 或很好反對4L PBS 在4� C 然後在室溫以2 更改1-2 個日。 9. 確定濃度使用spec 在absorbance 280nm 與A280 1.35 為IgG 或1.5 為很好。 10. 存儲在-80� C 在整除數。 抗血清的親合力洗淨使用DPT 紙 1 。運行SDS-PAGE 窗帘。(用途同樣多蛋白質儘可能沒有非常有您冒險一起運行範圍和沾染範圍利益) 。 2. 安置未沾汙的膠凝體在0.5 M KCl 裡10-15 秒-- 直到範圍開始出現。範圍將看上去確切, 當膠凝體的剩餘將轉動白色作為SDS 沉澱物。去除膠凝體一塊玻璃板和儘快刪去範圍利益。如果您太長期等待, 範圍將轉動白色。 3. 安置膠凝體strip(s) 入50 毫米NaPO4, 酸鹼度6.5 以0.1% SDS 和漂洗3 次, 以柔和震動, 30 min. 每沖洗。 4. 在第三次膠凝體洗滌, 開始APT 紙的起動。做這些步驟在冷室在冰浴。首先, 安置適當大小的張(輕微地大比膠凝體) APT 紙在冷的1.2N (100 機器語言) 被添加了3 機器語言鈉亞硝酸鹽的HCl (NaNO2) 。NaNO2 被做在水中在10 mg/ml 在用途前。孵化紙在冰與occassional 震動15-30 分鐘。本文應該轉動明亮的黃色。起動被二跟隨或更加迅速的冰水洗滌和二次迅速洗滌以50 毫米NaPO4 酸鹼度6.5, 需要5 分鐘為整體進程。(當我原始做了這, 我使用了要求5 次X 5 次周詳洗滌以冰冷水和一次隨後10 分鐘洗滌在寒冷50 毫米NaPO4 的一個協議, 酸鹼度6.5 。但是, 生物隨機存取磁碟強調短的洗滌必要。兩個似乎運作為我。) 5. 在起動之後, 設置調用在寒冷使用50 毫米NaPO4, 酸鹼度6.5 如同調用緩衝。調用4 時數在0.6 安培(Hoefer TE-52) 。本文應該轉動了orangey (桃子) 顏色。膠凝體是的Ususally, 顏色是更輕的。 6. 阻攔DPT 紙在以下緩衝2 或更多時數: 0.25% 明膠(0.5 g) 首先溶化由熱化 20 機器語言氨基乙醇 20 機器語言1 M Tris-HCl 酸鹼度9.0 _______________________ 對200 機器語言與dH2.O 7. 沖洗廣泛在"緩衝1" 從事阻攔的步驟。做至少3 20-30 次分鐘洗滌。 緩衝1: 50 毫米Tris-HCl, 酸鹼度7.5 5 毫米EDTA 150 毫米NaCl 8. 檢查調用效率, 削減小條的DPT 紙的一邊到蛋白質調用了並且孵化與您的(適當地被稀釋的) 抗體隔夜。(稀釋抗體在緩衝1 包含0.25% 明膠, 或1% BSA [ 斯格碼分數v ] 。我使用BSA 。) 維持以正常協議為immunobloting, 即漂洗(緩衝的3 更改1 或PBS) 30 分鐘, 孵化2-4 時數在peroxidase 被共軛的附屬抗體, 漂洗, 顯現出在0.05% 4 chloro 1 napthol (彌補作為一個0.3% 解決方法在甲醇裡), 0.01% H2.O2 在PBS 。回應看在看見在硝化纖維素的DPT 紙通常不一樣分明像。 9. 如果您等待以前檢查調用效率使用DPT 紙, 正義存儲紙在緩衝1 在4.o C 直到用途。 10. 使用抗原跳起DPT 紙: a. 剪切了紙成小正方形(在一塊玻璃板) 與一個乾淨的剃鬚刀。 b. 安排擺正在10 機器語言注射器裡與大測量儀針 c. 孵化以抗血清(我的適當的稀釋的5 機器語言使用稀釋2 倍被集中比那被使用為immunoblotting) 。稀釋被做在緩衝1 與BSA 或明膠。隔夜孵化以蒼勁震動。我做這在R.T. 沒有任何問題 d. 第二天早晨, 噴在被稀釋的抗血清之外(從哪epitope 特定抗體據推測被去除了) 並且把大約10 機器語言緩衝引入1 注射器。迅速地震動和重複為一個總額3 沖洗(30 分鐘每個) e. 洗脫特定抗體, 使用4 機器語言5 M NaI 被彌補的新鮮在冰裡H2.O 。勾畫入注射器和安置在冰; 鼓動由注射器的自轉在冰8 分鐘 f. 強制NaI 解決方法(現在包含被洗脫的抗體) 入管(50 機器語言獵鷹類型) 包含600 緩衝ll 1/1% BSA 。一再強制緩衝1 通過DPT 紙, 合併所有這些洗滌在同樣50 機器語言管直到一個總額40 到50 mls 被到達。(您可以必須稀釋更加進一步如果對抗體的意欲的用途是為螢光免疫檢驗法。是太高鹽的濃度干涉熒光形象化) 。 g. 集中抗體: 替代# 1 。 集中使用Millipore 可浸入的CX-10 補白。準備補白由漂洗用dH2.O 和然後過濾通過大約5 機器語言1% BSA/Buffer 1 阻攔站點(防止未指明黏附對補白) 。集中下來對2-4 mls, 根據您的抗體, 給最終運作的稀釋為immunoblotting 。如果需要, 進一步集中為螢光免疫檢驗法, 或為稀釋以阻攔的緩衝(即5% 康乃馨立即牛奶) 您的選擇(為immunoblotting) 。 替代# 2. (快速地) a. 準備二amicon centricon 補白(30,000 兆瓦切除) 由添加300 機器語言緩衝#1 1% BSA 。 b. 安排一個一半5M NaI/antibody 解決方法在每個的上部水庫二centricon 補白。使用pasteur 吸移管, 攪動混合二個解決方法。 c. 旋轉在5000 x g 30 分鐘。(用途parafilm 做補白適合入電動子適配器。 d. 在旋轉, 放棄通過了補白的液體之後(即液體在更低的水庫) 。 e. 帶來液體殘餘在上部水庫(100-500 機器語言) 給2 mls 的數量以緩衝1 。 f. 旋轉再在5000 x g 30 分鐘。 h. 通過了補白的放棄液體。 i. 添加250 機器語言緩衝1 來各個上部水庫和蓋帽與存貯水庫。 j. 倒置管和旋轉在表裡分離2-3 分鐘調用整個範例入存貯水庫。 NB. 補白可能被重新使用為同樣抗體的被重複的洗淨。存儲在室溫以1 機器語言緩衝1 在上部水庫。 11. 存儲DPT 正方形在注射器在緩衝1 在4.oC 。我使用了迭氮但一再從未使用了正方形(10-12 次) 在6 月份中沒有任何問題。 Immunoprecipitation 1. 收穫5 x 106 - 4 x 107 cells/sample 根據怎樣豐富您的蛋白質是。使用5 x 106 cells/sample 對IP 肌球蛋白, 4 x 107 cells/sample 對IP dynein, 例如。洗滌電池兩三次在DB, 和重新懸掛在500 m l DB/sample 。安置在冰。 2. 添加相等的數量2X IP 緩衝(使新鮮) 並且混合在冰: 2X 緩衝為dynein IP: 100 個毫米管道, 酸鹼度7.5 2% NP40 10 毫米EDTA 50 毫米NaPPi 200 毫米NaF 5 毫米DTT 2 毫米PMSF 100 m g/ml leupeptin 100 m g/ml pepstatin 2 毫米ATP 2X 緩衝為肌球蛋白IP: 40 毫米Tris, 酸鹼度7.5 0.2% NP40 2 毫米DTT 10 毫米EDTA 2 毫米PMSF 200 m M TPCK 200 m M TLCK 20 毫米NaHSO3 50 毫米NaPPi 200 毫米NaF 2 毫米ATP 200 毫米KPO4 3. 添加100 m g/ml RNAse A 。 4. 分離lysate 18K, 30 分鐘, 2 度, 在SS34 電動子裡 5. 收集被清除的lysate 。使用1 機器語言lysate 每IP 範例。添加主要抗體: 為NW127 dynein HC Ab, 添加50 ul serum/sample 為142, 143, 144 dynein IC 吸收, 添加50 ul serum/sample 為9E10 anti-myctag Ab, 添加200 ul supernatant/sample 為396 肌球蛋白Ab, preincubate 25-30 m l GammaBind 或蛋白質sepharose 小珠以1 機器語言396 上層清液4 時數對隔夜。下面洗滌小珠正如每步驟10-11 和重新懸掛小珠直接地在1 機器語言被清除的lysate 。跳過步驟6-7 和進入直接地步驟8 。 6. 晃動在冷室2 時數對隔夜。 7. 添加25-30 ul 蛋白質sepharose 泥漿為兔子和匯率主要抗體; 添加25-30 ul GammaBind 泥漿為滑鼠主要抗體。 8. 晃動在冷室1-4 時數。 9. 轉動在小珠下在5K 2 分鐘在microfuge 。 10. 每次洗滌小珠兩次以1 機器語言1X IP 緩衝與1 mg/ml BSA (減少背景, 調整IP 緩衝酸鹼度到7.0 對洗滌) 。如上所述轉動下來。 11. 每次洗滌小珠兩次以1 機器語言1X IP 緩衝, 酸鹼度7.0 沒有BSA 。如上所述轉動下來。 12. 如果需要, 做一次最終洗滌在1X IP 緩衝與0.5M NaCl 。這進一步將減少您的背景。但是, 它將剝離dynein IC HC 當做IPs 與NW127 Ab! 13. 去除洗滌緩衝所有跟蹤, 和重新懸掛小珠在20-30 m l 2X SDS 範例緩衝。煮沸5 分鐘。轉動在小珠, 負荷下超級SDS 膠凝體。IgG 重的鏈子運行在50 kd; IgG 輕的鏈子運行在22 kd 。 注: 如果您有很多背景, 它也許幫助preincubate 被清除的lysate 與小珠(沒有抗體!) 兩三時數吸附在任何未指明的捆綁之外。轉動在小珠下, 收回lysate, 和添加主要抗體。繼續進行步驟5 。 1/95, Trivinos 特定詳細資料為肌球蛋白Ips 1 。電池被收穫了和被洗滌了在無Ca2+ MES 飢餓緩衝(20 毫米MES, 2 毫米MgSO4) 。 2. 冰冷2 x 病勢漸退緩衝然後被添加了來電池暫掛。(40 毫米Tris Cl pH7.5, 0.2% NP40, 2mM DTT, 10 毫米EDTA, 2 毫米PMSF, 2 毫米馴服, 200 m M TPCK, 200 m M TLCK, 20 毫米NaHSO3, 100 m g/ml RNAse A, 50 毫米鈉焦磷酸, 200 毫米NaF, 2 毫米ATP, 和200 毫米磷酸鹽pH7.5) 3. 漩渦和然後分離30 分鐘以microfuge 的最高速度。 4. 上層清液調用了到管包含mAb 和20 m l 1:1 蛋白質A sepharose 泥漿, 並且管隔夜是被轉動的結束在結束在4 oC 。 5. immunoprecipitate 然後被洗滌了至少6 次與MES 鹽buffer(20 機器語言MES 酸鹼度6.8, 20 毫米NaCl, 1 毫米EDTA) 5 min. 各個。 6. 小珠被射擊了2 min. 在microfuge, 重新懸掛入2 x SDS 範例緩衝, 煮沸5 min. 在90 oC 沙子浴。 7. 泥漿再被射擊了, 保留和上層清液。 8. 運行SDS-PAGE 。 (P.C., 01/30/95) 注: IgG 重的鏈子將運行在50kd IgG 輕的鏈子將運行在22kd 整體IgG 運行在150kd 需要擔心洗滌劑被使用溶解電池禁止Ab 捆綁。 需要擔心immunocomplex 是可溶解。 需要工作在相等(Ag:Ab 比率) 區域。 代替2� GAMIgG 可能使用整體葡萄球菌aureus, 蛋白質A, 更好比蛋白質A, Prot.A/Prot.G 混合的蛋白質G (皮爾斯·Immunochemicals), 或antimouse 束縛對IgG1 Affigel 。 能從immunocomplex 發行抗原根據0.1M 氨基乙酸酸鹼度2.5 酸震動, 或高鹽(3M NaSCN) 震動, 然後通過通過Costar Spinex 0.22m m 補白部件入Eppendorf 。 能增加1� 滴定量; mAb 由通過9E10 媒體Sepharose CNBr 小珠, 這束縛IgG 的5 個或更多Fc 部份有效做它IgM 。 能增加1� 滴定量; mAb 由添加飽和的NH4SO4 的相等的數量dropwise 來轉動9E10 媒體在roomtemp, 射擊沉澱物在2500g 為5min, 重新懸掛桃紅色(RPMI) 藥丸在dH20, 重複降雨雪。 做飽和的NH4SO4: 煮沸水, 添加NH4SO4 直到水晶落在解決方法外面, 冷靜來RT, 酸鹼度到7.0 與NH4Cl, 過濾通過3MM 紙。 能生長9E10 電池在2% FCS 降低沾染Ig 。 微小等級抗體交換親合力洗淨為噬菌的克隆的間接螢光免疫檢驗法和epitope 選擇。 這個協議利用情況抗體迅速地調用在抗原範例之間附上分離堅實技術支持。它比抗原picamole 允許一對親合力淨化少量抗體使用較少。這是偉大的為做螢光免疫檢驗法與短缺或抗原短缺的骯髒的抗體, 或為快速篩選表達式克隆為epitope 選擇。 為螢光免疫檢驗法: 1. 固定您的抗原在一1 cm2 硝化纖維素芯片。例如, 察覺汙點1-10 ng 當地Dicty dynein 在10 m l P100 緩衝硝化纖維素芯片。這是您的來源汙點。做一個來源汙點為您希望弄髒的每coverslip 。 2. 讓硝化纖維素乾燥標記蛋白質支持與鉛筆。塊在5% milk/PBS 30 分鐘。來源汙點可能被存儲在阻攔解決方法在冰箱如果NaN3 被添加來0.02% 。 3. 孵化抗原來源汙點與抗體在PBS/0.1%BSA 4 時數對隔夜。處理汙點與直言的鑷子。使用給好結果以西部汙點抗體的稀釋。井在24-well 板材是好的為這如果您有幾個範例。 4. 洗滌來源弄髒3 乘5 分鐘與PBS/0.5% 非離子活性劑20 。 5. coverslip 範例為間接螢光免疫檢驗法做準備(參見相關的部分在labman) 。安置50 m l PBS 在固定, 封鎖的coverslip 。安置被洗滌的來源汙點, antigen/Ab 複雜下來, 在coverslip 頂部。孵化在37 度, 1 時數, 在潮濕分庭。抗體在來源汙點迅速地將平均與抗原在固定的電池在coverslip 。繼續進行洗滌和附屬抗體正如每螢光免疫檢驗法協議。 6. 來源汙點可能被重新使用如果廣泛地洗滌和存儲在PBS/0.1% BSA/0.02% NaN3 。每次Re-incubate 與抗體。 為表達式克隆的epitope 選擇 1. 長大密集IPTG 導致(clonal!) 噬菌的板材和推力表達了融合蛋白質硝化纖維素補白和平常一樣。 2. 阻攔噬菌的補白在5% milk/PBS 30 分鐘。孵化與抗體1-4 時數在同樣稀釋使用篩選噬菌的圖書館。洗滌補白在PBS 。這些是您的來源補白。 3. 運行被淨化的或被豐富的抗原範例的窗帘SDS 膠凝體。弄髒膠凝體硝化纖維素和標記蛋白質邊以一條鉛筆線路橫跨汙點的整個寬度。塊在5% milk/PBS 為30 分鐘和剪切成小條。 4. 孵化各來源補白被測試以窗帘膠凝體小條。安置來源補白和汙點小條以蛋白質邊面對在密封膳食袋子。添加剛夠PBS/0.1%BSA 弄濕兩個汙點。密封袋子。這時不要添加抗體! 5. 一起孵化汙點1-4 時數。然後廣泛地取消汙點小條和洗滌在PBS 。不要混合小條在洗滌的解決方法或附屬抗體解決方法, 如同抗體也許調用在小條之間。孵化小條在適當的附屬抗體1 個小時。洗滌和開發小條。 6. 如果噬菌的克隆輸入一真實地正DNA, 對應的小條將是正。負小條表明假的正噬菌的克隆。 1/95, Trivinos (從Hammarback 和Vallee 1990 年, JBC 265:12763) 為時由Cellbiogal 編輯; 09-06-2006 下午08:09。        |
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