Monoclonal 抗體的生產

Cellbiogal · #1 (**permalink**) 09-06-2006, 下午07:55

Monoclonal 抗體的生產

射入協議(4 個星期協議):

日0: 第1 免役: 混合在緩衝被溶化的蛋白質裡與Freund 的完全輔藥在比率1:1; 用途大約100 g 每滑鼠(參見協議為polyclonal 抗體) 。

日14: 第2 射入: 為第2 到第4 射入用途Freund 的未完成輔藥。

日21: 第3 射入

日28: 第4 射入

免役測試由Immunoblot 並且/或者螢光免疫檢驗法:

日30: 從尾巴靜脈收集一些血液; 分離清液和使用為免役測試。

* 抗體渴望的滴定量應該是:

(a) immunoblot: 更好比1:300 (prefered 1:1000)

(b) 螢光免疫檢驗法: 更好比1:20 (refered 1:50)

媒體和解決方法的準備:

* DMEM 媒體
* DMEM 媒體+ 10% 胎兒小牛清液+ 10 M mercapto 對氨基苯甲酸二
* HT 媒體
添加HT 補充條款, 50x 股票(Gibco # 41065-012) 對DMEM/FCS
* 帽子雜種選擇媒體
添加帽子補充條款, 50x 股票對培養基(Gibco # 21060-017); 2 機器語言+ 98 機器語言培養基)
* 病勢漸退媒體
* A: 0.83 g NH4Cl/100 機器語言, 酸鹼度7.2 。
* B: 2.06 g Tris/100 機器語言, 酸鹼度7.2 。
* 混合9 機器語言A 以1 機器語言B

X63 Ag 8.653 非藏匿的骨髓瘤電池文化:
o 開始骨髓瘤電池的細胞培養大約7 個到10 個日在電池融合之前。
o 測試對於帽子缺乏由cultering 一些電池在帽子媒體。

為融合的不�&的工具: 3 個不�&的陪替式培養皿; 不�&的15 機器語言圓錐形管; 不�&的50 機器語言圓錐形管; 至少2 把不�&的鑷子; 至少2 不�&的剪刀; 不�&的鐵絲網屏幕(0.5 毫米網格大小; 能被獲得在局部metall 存儲作為不鏽鋼, 電匯屏幕。); 不�&的Pasteur 吸移管; 計算器; 幾條不�&的小船; 不�&的藍色& 黃色要訣; haematocytometer; DMEM 媒體, HT, & 帽子媒體; DMSO; 色氨酸藍色; 不�&的3 cc 塑料注射器; PEG/DM 如此解決方法(斯格碼貓。# P-7306)

融合協議:

一個滑鼠653 骨髓瘤電池脾臟
1. 從滑鼠去除脾臟在不�&的情況(左手邊下) 。
2. 去除肥胖組織和洗滌2 時間以DMEM 媒體在陪替式培養皿。
3. 剁碎脾臟與剪刀和按通過一個0.5mm 電匯屏幕使用3 cc 注射器柱塞。
4. 洗滌屏幕以10 機器語言EGELS 媒體。
5. 調用電池對15 機器語言圓錐形管和允許大塊結算大約5 分鐘。
6. 調用上層清液到新建15 機器語言圓錐形管。
7. 轉動在1300 轉每分鐘5 分鐘。
8. 放棄上層清液。
9. 重新懸掛在10 機器語言病勢漸退緩衝(溶解紅血球); A: 0.83 g NH4Cl/100 機器語言, 酸鹼度7.2; B: 2.06 g Tris/100 機器語言, 酸鹼度7.2 。與1 機器語言B 混合9 機器語言A 。
10. 准許溶解10 分鐘和轉動在1,300 轉每分鐘5-10 分鐘。1 。判斷骨髓瘤電池的質量: 光滑, 圓形是重要為好融合。
11. 重新懸掛在10 機器語言DMEM 媒體; 採取整除數和稀釋它1:50 為電池計數; 轉動在1,300 轉每分鐘5 分鐘。2 。轉動在1,200 轉每分鐘5 分鐘。

計數電池:
12. 重新懸掛在20 機器語言DMEM 媒體。
13. 電池計數: _____ x 108 在10 機器語言培養基。

F1 。2 機器語言Hybri 最大融合媒體(斯格碼P-7306) 用DMEM 媒體稀釋對47% 釘。
F2 。與2 個x 107 個骨髓瘤電池結合1 個x 108 個脾臟電池(10 機器語言) 在定量5:1 和分離在1,200 轉每分鐘5 分鐘。
F3 。放棄上層清液, 鬆開藥丸由摩擦管沿敞篷的金屬網格。
F4 。添加融合媒體, 柔和地重新懸掛藥丸和讓立場確切地1 分鐘。
F5 。添加10 機器語言DMEM 媒體dropwise 當震動。慢慢地添加額外10 機器語言DMEM 媒體當混合。
F6 。轉動在1,200 轉每分鐘5 分鐘, 放棄上層清液。
F7 。重新懸掛在10 機器語言帽子媒體。確定電池的總數: _____ x 108 。
F8 。稀釋對0.5 x 106 cell/ml 。280 機器語言帽子媒體。
F9 。板材入____ 96-well 板材; 200 升每井。

協議由Walter 斯蒂芬。

sergbio · #2 (**permalink**) 01-13-2007, 下午05:23

喂Cellbiogal!

什麼您意味在100g 之下每滑鼠為第1 免役。能您解釋什麼recomb 蛋白質的數量是優選的為免役計劃(或它是單獨的為各蛋白質!

謝謝!

admin · #3 (**permalink**) 01-13-2007, 下午07:59

我認為她意味做以下:

溶化您的蛋白質與Freund 的完全輔藥在比率1:1
(50%/50%)

然後請稱100 g 。

歡迎到論壇
Sergbio!

sergbio · #4 (**permalink**) 01-16-2007, 下午06:26

喂admin!

謝謝解釋, 但我認為有差錯(沒有100 g 但100mkl, 因為它非常難想像100g\per 滑鼠(滑鼠重量是近的20g) 的地方

)

sergbio · #5 (**permalink**) 01-18-2007, 下午12:56

HI!
有人是知道關於抗原的來源為準備人的CD8 Mab HYBRIDOMA 嗎? (我意味再組合蛋白質或被熔化的peptides 或別的?)

根據電池線路和hybridomas 的ATCC 收集, 為了免役研究員使用他們使用在Elisa 為克隆選擇的淋巴細胞/但什麼樣的抗原? (CD8 如同我知道8 peptides 複雜以兆瓦在25kDa 附近)

謝謝!

remo · #6 (**permalink**) 02-17-2008, 下午01:57

喂
Iwant 知道關於Genomic 抗體技術

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