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科學是無知地勢。~Oliver Wendell Holmes, Sr., 醫療雜文1883 年
蝦鹼性磷酸鹽或樹汁, 是摧化5 磷酸鹽dephosphorylation 從’ 核酸dephosphorylating 的核糖核酸或DNA 末端的酵素。
注意PCR 產品和底漆並且沒有phosphatases 在他們的自由末端, 並且需要因此是磷酸化的在克隆之前如果您使用de 磷酸化的傳染媒介!
樹汁是溫度不穩定是因此您可能容易地停用這酵素(與CIP 比較!) 。樹汁被停用以65.C 熱水鍋孵出15 分鐘。
您不得到實際上回應。樹汁要求至少10mM 氯化鎂(但蝦鹼性磷酸鹽的優選的□活性是在20-25mM 氯化鎂) 並且這有效很好在酸鹼度8.0 。
對DNA 末端(2.5 ug dephosphorylate 1 pmol 3 Kb 質粒), 為了1hr 在您需要的37.C:
樹汁0.1 部件為5' 突出物, 0.2 部件為直言和0.5 部件為3' 垂懸。
酵素來1 個部件每ul, 因而是安全的您可能使用approx.0.5 部件為2 ug 。
要訣: 樹汁酵素可能被添加直接地來限制文摘! 因而整體行動包括限制酵素消化、dephosphorylation 、酵素鈍化作用, 結紮術或5’ 結束標記可能執行在一支唯一管裡由添加適當的試劑。這將允許您節省時間和是高效率的!
討論和過帳問題對此在蝦鹼性磷酸鹽和 DNA 克隆論壇 !
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