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但至於為某一真相, 人工不知道它, 亦不他將知道它; 不神, 亦不我講話的所有事。並且既使偶然他將說出最終真相, 他他自己不�&知道它; 為全部是而是猜測一個被編織的萬維網。~Xenophanes (c. 570-c 。480 BCE) 希臘哲學家。
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| 11-29-2007 上午03:39
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dnamolecule " | 0 | 391 | |
| 01-24-2008 下午11:06 | 2 | 444 | |
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| 07-31-2006 下午11:11 | 0 | 1902 年 | |
| 03-16-2007 上午05:34 | 0 | 488 | |
| 12-31-1969 下午11:00
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| 03-21-2008 下午03:48 | 0 | 275 | |
©2006 分子崗位
資訊關於怎樣成為關於限制酵素和消化DNA 的一位專家!
限制酵素(或限制endonucleases) 是剪切double-stranded DNA 由做二個中斷的酵素, 一個通過每個雙螺旋的磷酸鹽中堅。酵素做這沒有損壞DNA 的基礎。雖然酵素中斷DNA, 化學鍵可能由其它酵素改革以DNA 連接□著名。所以, DNA 的限制片段從不同的染色體或基因可能一起被綁紮, 提供他們的末端補全。
情況DNA 能被操作並且不同的DNA 片斷能一起現在被接合, 被開放的新建研究領域如今想像。許多方法在分子生物學今天依靠限制酵素。"限制" 從情況被派生這些酵素initally 被發現了在 看上去 制約特定噬菌體的E. 桿菌("病毒的" 傳染細菌) 。它被相信限制酵素是主機防禦結構由細菌演變和其它有機體抵抗病毒傳染, 和幫助以病毒順序的排除。
1978 年, 諾貝爾獎為醫學被授予了到Werner Arber, 丹尼爾·Nathans 和哈密爾頓史密斯為在限制endonucleases 的他們的發現上, 導致重組脫氧核糖核酸技術的發展。對限制酵素的第一實用用途在科學和醫學是E. 桿菌細菌的 操作 表達再組合人的胰島素為糖尿病患者。
限制 □活性部件由數量restrition 酵素定義必需剪切1 微克噬菌體lambda DNA 對完成在1 時數的時期。
檢驗由酵素的製造商開發是很可能完成使用高度被淨化的DNA (即質粒或lambda 噬菌的DNA) 作為基體, 並且導致最佳的結果以他們的特殊準備的檢驗適應。經常實驗室條件作為理想不是, 並且酵素或一個更加長式的潛伏期輕微的超額使用幫助保證完全消化。
有將運作與各種各樣的酵素的許多' 普遍' 酵素緩衝, 但他們經常不符合任何一酵素的最高效率的要求。由於普遍緩衝像高效率不是, 我們不推薦他們的定期用途在實驗室裡(特別是為複雜genomic DNAs; 複雜genomic DNAs 文摘通常是以將禁止酵素的高DNA 含量; 還, 需要更多部件酵素ard 更久的孵出時間為完全消化) 的相對地粗暴DNA preps 也許包含抗化劑。這總是最佳使用製造商的被推薦的檢驗條件為restricition 消化。一些製造商克隆了有非常不同的需求從其它同樣酵素的版本的酵素, 因此以前檢查使用。酵素含量總被給在酵素管的邊。限制酵素被使用在實驗室裡總被存儲在-20 攝氏度(在丙三醇基礎), 和應該被保留儘可能與-20 攝氏度接近延長酵素的壽命。當設置文摘, 帶來回應管給酵素冷凍機在冰桶; 從冷凍機去除酵素管和保留管在冰當工作與酵素。退回立即管到冷凍機當完成。使用pipetmen 選定限制酵素唯一和總使用一個新pipetman 要訣當去除酵素從儲蓄管。
通常DNA 消化被�&辦在25 - 50 ul (微升), 當您想要檢查或分析您的DNA 。這些叫做分析限制酵素消化。
你可能消化0.25 到2 ug (微克) 為分析準備。這是因為在agarose minigel (30ml), 你可能近似地形象化05.ug (50 ng, nanograms) 每範圍。範圍的形象化取決於DNA 的長度和相當數量DNA 存在。總之, 更加長式DNA 當前在範圍, 更加容易是將是看見。
許多微克和更大的容量的DNA 消化從50 - 500 ul (微升) 或更多是預備的, 意味您DNA 片段為隨後洗淨做準備和克隆。
食譜 為限制酵素消化:
分析
10X 限制酵素緩衝 |
10 ul |
DNA (許多微克DNA) |
"X" ul DNA 20 或更多ul |
水 dH2.O(millipore 或真空加熱) |
86 - x ul |
限制酵素 (10-20 U) |
4 ul |
| 總額 | 100 ul |
您也許添加Mg2+ 來消化回應(以MgCl 的形式) 如果您使用DNA 的一個大數量。您應該做這特別是如果緩衝您洗脫了您的DNA 在被包含的EDTA 裡。這是因為如果"X" 是大的, ie > 20ul 數量, 您也許需要添加鎂EDTA 困境來4 摩爾鎂為每摩爾EDTA 。因而, DNA 在EDTA 的一個1 毫米(milimolar) 解決方法將束縛4mM 鎂。一個好經驗法則將添加1 1ul 10mM MgCl 來DNA 每20ul 。
預備
10X 限制酵素緩衝 |
5 ul |
| DNA | "X" ul DNA 0.25 到10 ul |
水 dH2.O(millipore 或真空加熱) |
43 - x ul |
限制酵素 (10-20 U) |
1 ul |
| 總額 | 50 ul |
孵化在37.C 1 - 3 時數。
1 個部件是足夠的酵素對digest1 ug DNA 至少在1 時數。消化3 時數您能消化金額上限DNA 。因為您添加酵素10-20 個部件, 您能甚而消化DNA 10ug 在1 時數! 酵素是昂貴的多餘地不浪費他們!
附註關於酵素用量:
參考:
Sambrook 、J. 、Fritsch, E.F., 和T. Maniatis.(1989) 分子克隆, 實驗室手冊。再版。冷的春天港口實驗室按。頁5.3- 5.32 。
©2006 分子崗位
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