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Genomic DNA 隔離協議

選擇Genomic DNA 洗淨方法

genomic DNA 隔離的目標依靠什麼DNA 的申請在隔離以後。純淨、來源、DNA 的數量和質量是需要被論及在genomic DNA 提取之前的所有問題。一個整體許多不同的方法, 技術和工具箱是可利用的現在對研究員隔絕genomic DNA 從電池。

DNA 的數量需要
DNA 的分子量和範圍
DNA 純淨要求了
DNA 的順流申請
可利用時率
DNA 提取技術或方法舒適
費用或貨幣可利用

家種或實驗室特定DNA 提取方法為開發了他們和的實驗室正常經常相當很好使用這些協議。

注意然而這些方法缺乏標準化。並且DNA 產量和DNA 質量總不是可再生的從一個人員對下。

背景在Genomic DNA 隔離和洗淨

通常, 所有方法介入電池中斷和病勢漸退。這被核糖核酸撤除有時跟隨(由RNAses 、鹽或其它方法) 。選擇哪個方法使用將取決於許多選擇系數包括:

DNA 與蛋白質被隔絕由幾個方法包括蛋白質的消化由酵素proteinase K. Proteins 被salting-out, 有機提取, 或束縛DNA 隨後去除對固體階段技術支持(譬如anion-exchange 列或硅土技術) 。

DNA 由對氨基苯甲酸二降雨雪或異丙醇降雨雪收回最終。

總之, DNA 的分離從電池和蜂窩電話要素可能被劃分成�&個階段:

電池中斷
電池病勢漸退
蛋白質和汙染物撤除
DNA 恢復

在一些genomic DNA 隔離協議, 階段1 和2 被結合。

材料需要為Genomic DNA 提取方法

病勢漸退緩衝為Genomic DNA 食譜:

50 毫米Tris-HCl, 酸鹼度8.0
50mM EDTA
1% SDS
10mM NaCl

Genomic DNA 洗淨方法從組織樣品

選擇組織樣品使用。確定範例準備和適當地被保留在冰。如果範例立即不�&被使用為DNA 提取, 範例必須適當地然後被存儲在或-20.C 冷凍機為較長期或4.C 為短期(少量時數) 用量。
剪切組織成更小的片斷。為肝臟或其它軟的組織, 不要擔心做美好的片斷。
添加組織來被預冷卻的(乾冰) 灰漿, 添加立即液氮N2 。
開始研組織入美好的粉末。依照必要添加更多Liq. N2 。調用冷的粉末到30 機器語言管, 事假開蓋因此N2 可能蒸發。
添加9 機器語言每被溫暖的(5.C) 病勢漸退緩衝和柔和地重新懸掛粉末。
添加Proteinase K 10mg/ml 100 ul, (即, 100 ug 在解決方法) 。孵化55.C 1-18 時數。階段性地柔和地混合。添加Proteinase K 在第一2 時數以後, 最佳100 ul: 3 時數添加Proteinase K 在1.5 時數。
款待範例非常柔和地。加1 機器語言3M Na0Ac (酸鹼度4.0), 10 機器語言溫暖的(55.C) 酚, 柔和地但throughly 混合5-10 分鐘。
分離範例15 分鐘。
重複溫暖的酚提取。
解壓縮與相等的數量(10ml) 酚: CIA (1 份phenol:1 零件CIA: CIA = 23 份chloroform:1 零件異戊基的酒精)
解壓縮以相等的數量(10ml) CIA 提取
上部階段應該是相對地清楚的, 如果它包含大白色影響, 或是非常乳狀的, (i) 再孵化在68.C 15 min., 和re 酚解壓縮, (ii) 起始時間, 但長期孵化與P-K 。
調用上部階段對新建管。添加冷的對氨基苯甲酸二的2 個數量和柔和地混合(鹽: Na0Ac 已經是在解決方法) 。使用異常分支和被密封的pasteur 吸取短管軸在DNA 之外。抹超額對氨基苯甲酸二在管的邊。重新懸掛在TE 2-5 mls 。確定DNA 完全地被溶化(事假在柔和的振動器。)
添加RNase 混合(100 ug RNase RNaseT1 A, 10U) 。孵化30 極小的37.C 。** 您能添加RNase 在proteinase K 之前, 孵化在37.C 1 個小時和然後開始proteinase 消化。您能然後跳過步驟15 - 。
添加100 ug Proteinase K, incubae 37.C 30 分鐘。
添加1/10 卷3M Na0Ac, 酚解壓縮一次, Phenol:CIA 解壓縮兩次, CIA 解壓縮一次。
添加EtOH 的2.5 數量, 投入在-20.C 30 分鐘。分離20 分鐘。
洗滌很好與70%, 去除所有EtOH 。如果您烘乾, 不乾燥。
重新懸掛仔細地, 慢慢地in1-2mls TE (Tris Edta 緩衝) 。(1x 或0.1x) 。

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