檢驗的DNA- 蛋白質交往

得知怎樣檢驗DNA 蛋白質交往。

檢驗的DNAProtein 交往

有檢驗DNA 蛋白質交往的�&個重要技術。第一二個技術(補白捆綁和膠凝體流動性班次) 確定如果您的DNA 與蛋白質相處融洽。其它二個技術(DNase Footprinting 和DMS Footprinting) 表明何處交往目標站點在蛋白質和DNA 之間說謊在DNA 。

補白捆綁

硝化纖維素膜補白是常用過濾消毒解決方法。硝化纖維素補白可能束縛DNA, 但只在某些情況下。Singlestranded DNA 欣然束縛對硝化纖維素, 但雙擱淺的DNA 單獨不。另一方面蛋白質束縛, 並且如果蛋白質一定對double-stranded DNA 蛋白質Dna 複雜將束縛。參見硝化纖維素補白約束檢驗條款對於更多資訊。

形成膠凍流動性班次

為了評定DNA 蛋白質交往這個技術依靠事實一小DNA 比同樣DNA 有更高的流動性在膠凝體電泳法當它將跳起對蛋白質。我們能因此標記排序雙擱淺的DNA 片段, 那麼與蛋白質混合它, 和electrophorese 複雜。然後我們服從膠凝體在自動射線照像術檢測被標記的種類。DNA 的小範圍是重要在這個檢驗。如果一個整體基因被使用了其流動性已經�&是非常低, 並且流動性班次由蛋白質捆綁造成難檢測。所以我們必須近似地知道何處蛋白質束縛對DNA 因此我們能準備一個短的限制片段, 甚至將包含目標站點為蛋白質的一綜合double-stranded oligonucleotide, 但少許。

DNase Footprinting

一旦我們知道蛋白質束縛對一指定的DNA 我們能使用footprinting 發現何處目標站點說謊在DNA 。Dnase footprinting 依靠情況蛋白質, 由束縛對DNA, 蓋束縛位置並且因此保護它免受攻擊由Dnase 。這樣它留下"腳印" 在DNA 。第一步在一個footprinting 的實驗是結束標記DNA 。我們能標記或者子線, 但只一個每實驗。其次, 我們束縛蛋白質對DNA 。然後我們對待DNA 蛋白質複雜與Dnase I 在溫和條件(很少Dnase 下), 以便平均數僅僅一個被削減發生每DNA 分子。其次, 我們從DNA 取消蛋白質, 分離DNA 子線, 並且electrophorese 收效的片段在高分辨率polyacylamide 形成膠凍沿著範圍標記。片段將出現從DNA 的另一末端, 但我們不�&檢測他們因為他們是未貼標籤的。我們總包括一個控制與DNA 單獨(沒有蛋白質), 和通常使用超過一蛋白質含量因此我們能看由範圍的逐漸失蹤在腳印區域DNA 的保護取決於被添加的蛋白質的濃度。腳印代表DNA 的區域由蛋白質保護, 和告訴因此我們何處蛋白質束縛。

DMS Footprinting

Dnase footprinting 給束縛位置的地點的一個好想法為蛋白質, 但Dnase 是大分子和是因此為探查束縛位置的美好的詳細資料的一個相當直言的票據。哪些意味, 那那裡也許是空白在交往在蛋白質之間並且Dnase 不�&適合和因此的DNA 不�&檢測。而且, DNA 約束蛋白質頻繁地心緒不寧DNA 在約束區域之內, 變形雙螺旋。這些擾動是有趣, 但由Dnase 常規不檢測footprinting 因為蛋白質保持Dnase 去。做更加詳細footprinting, 我們需要可能適合入DNA 蛋白質角落和裂口複雜的一個更小的分子並且顯露更多交往的微妙。為這個工作的一個喜愛的工具是甲基化的座席dimethylsulfate (DMS) 。

用DMS footprinting 我們開始以與在Dnase 裡footprinting 相似的方式, 由結束標記DNA 和捆綁蛋白質。然後我們甲基化DNA 蛋白質複雜與DMS, 使用一張溫和的處理以便平均只一甲基化甚而發生每DNA 分子。其次, 我們撞出蛋白質, 和對待DNA 與取消甲基化的嘌呤的試劑, 創建apurinic 站點(deoxyriboses 沒有基礎) 在DNA 。然後我們中斷DNA 在這些apurinic 站點。這些回應是相同像Maxam-Gilbert DNA 程式化回應。最後我們electrophorese DNA 片段和autoradiograph 膠凝體檢測被標記的DNA 結合。各個範圍結束在由蛋白質甲基化和因而無保護的nucleotide 旁邊。

看見 DNA 分子在3 維數

脫氧核糖核酸