Bioinformatics, 協議, DNA 核糖核酸蛋白質Proteomics
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最卓越的發現由科學家做是科學。~Gerard Piel
版權2007 分子崗位
DNase footprinting 是啟用DNA 蛋白質交往檢測由利用屬性的一個分子生物學方法蛋白質與DNA 相處融洽將保護DNA 在那個交往站點免受限制消化或DNAase enzymatic 卵裂。包含特定束縛位置的DNA 限制片段被標記在一個末端, 通常與32P 和被使用為footprinting 。
蛋白質和DNA 被允許一起雜交和束縛。
DNA footprinting 運用酵素DNase I 或 deoxyribonucleic 酸nuclease I 為了消化或任意剪切radiolabeled (或標記) DNA 留下蛋白質一定的DNA 被保護。DNA 限制片段輕微被對待與DNase I, 做唯一子線中斷(裂口) 在DNA 。小量的酵素被使用這樣, 有平均數少於1 nick/strand 。回應然後被終止, DNA 被弈質, 並且混合物運行在一弈質的polyacrylamide 程式化膠凝體。這些片段分離了由膠凝體電泳法由分析暴露檢測被保護的DNA 地區條帶卵裂模式在膠凝體。
DNA 的卵裂模式在沒有DNA 約束蛋白質時, 典型地指自由DNA, 與DNA 比較的卵裂模式在DNA 約束蛋白質面前。如果蛋白質束縛DNA, 束縛位置被保護免受enzymatic 卵裂。這保護導致一個清楚的面積在指"腳印" 的膠凝體。
由變化DNA 束縛的蛋白質的濃度, 蛋白質的約束親合力可能估計根據腳印被觀察蛋白質的極小的濃度。
2X 沒有KCl/為10mls:
金額: [ 最終]
Tris-HCl pH7.6: 1M 500 ul: 50 毫米
氯化鎂: 1M 125.ul: 12.5mM
EDTA: 2 ul 0.5M: 1mM
丙三醇: 2 mls: 20%
DTT: 1M 10 ul: 1 毫米
5X 沒有KCL
[ 最終]: 配料
20%: gylerol
5mM: 氯化鎂
2.5mM: EDTA
2.5mM: DTT
250mM: NaCl
50mM: Tris-HCL, 酸鹼度7.5
0.25mg/ml: 多(二dc) 多(二dc)
為10mls
氯化鈣: 1M 50 ul: 5 毫米
氯化鎂: 1M 100 ul: 10 毫米
裝載解決方法
0.1 M: NaOH:formamid (1:2 v/v)
0.1%: 二甲苯cyanol
0.1%: bromophenol 藍色
終止緩衝
10mls
NaCl: 400 ul 5M: 200 毫米
EDTA: 600 ul 0.5M: 30 毫米
SDS: 1 機器語言10%: 1%
TEBe (Tris EDTA Beta mercap 。)
Tris-HCl, 酸鹼度7.6: 1 M 500 ul: 50 毫米
EDTA: 0.5 M 2.ul: 1 毫米
Beta □基乙醇: 10 ul: 15mM
10 x K 緩衝
為1 機器語言
Tris-HCl 酸鹼度7.5: 1 M 100 ul: 100 毫米
氯化鎂: 1 M 100 ul: 100mM
DTT: 1M 50 ul: 50 毫米
dH2.O: 750 ul
DNA 被使用通常包含您的蛋白質束縛位置利益。DNA 被淨化, 那麼被消化以限制片段是appopriate 範圍。DNA 片段被標記在一個末端(束縛位置> 25 bp 從末端) 。
一子線標記可能是accomplised:
為Klenow 片段, 0.3.ug 帶來100 ul 在TE, 熱殺害Klenow 在68 .C 10 分鐘。
範例RXN: 15 ng 是對各種回應的需要。如果做探針為許多回應正義增量數量DNA 由300 ngs 決定。
15ng: DNA 片段
2 ul: 10x K 緩衝
5 ul: 32P dCTP 3.33 uM 10 uCi/ul
2 ul: 2mM @ dA, dG dTTP
1 ul: Klenow
20 ul 最終數量, 37.C 30 分鐘。
-- 添加1 ul 10mM dNTP, 5 分鐘@ 37.C 。
-- 添加80 ul TE 。68.C 15 分鐘, 投入了冰。
-- G-50 旋轉列(旋轉在大約2000g)
-- 添加1/10 卷3M Na0Ac, 2.5 數量EtOH, 冰30 分鐘, (選項如果[ DNA ] 是= 或> 3 ng/ul 您也許直接地張貼G-50) Microfuge 30 分鐘。
-- 洗滌與70%
-- 乾燥帶來5.ul
約束回應應該有在10 和150mM KCl 之間(更多鹽減少束縛但增量特異性) 。典型的濃度是50mM 。
蛋白質DNA 捆綁:
2X 約束緩衝25 ul 沒有KCl
3 ng/ul 5.ul unilabeled DNA
x KCl ul 等於10-150 毫米KCl
dH20 對等於50 ul 減數量為捆綁protien
1-3 DNA 約束蛋白質Footprinting 部件(或10 到160 ug 粗暴核解壓縮)
-- 混合柔和, 冰10 分鐘。
保留規定期限在頭腦裡,
-- 添加RT Ca/Mg 解決方法50 ul, 18.C 為1 分鐘。
-- 添加稀釋RQ1 DNase 的3 ul (0.05 u/ul 被稀釋在Tris) 孵化1 分鐘。
-- 終止添加90 用37.C 終止解決方法,
-- 您如果酚: CIA, 和CIA 解壓縮, 和對氨基苯甲酸二沉澱物。
-- 重新懸掛在裝載解決方法4.ul 。
-- 運行在5% 標準尿素Dna 程式化膠凝體(考慮楔子膠凝體) 與appopriate 裝載運輸路線譬如DNA 梯子、未割減的DNA, 和控制。
分析footprinting 的模式。
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