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| 線程數 | |||
| 線程數稱謂/海報 | 前筆過帳 | 回復 | 視圖 |
| 03-24-2008 下午02:03 | 1 | 355 | |
| 02-20-2008 上午08:45 | 1 | 592 | |
| 01-23-2008 上午04:17 | 2 | 454 | |
| 05-16-2007 下午06:30 | 0 | 897 | |
| 12-31-1969 下午11:00
由
" | 0 | 82 | |
| 03-28-2008 上午10:58 | 3 | 506 | |
| 07-19-2007 上午04:53 | 0 | 534 | |
| 06-04-2008 上午12:46 | 5 | 93 | |
| 11-12-2007 下午07:44 | 4 | 555 | |
| 01-24-2008 下午03:27 | 2 | 254 | |
| 09-17-2007 下午04:16 | 1 | 303 | |
| 12-05-2006 下午09:49 | 2 | 1288 年 | |
| 01-24-2008 下午10:15 | 0 | 371 | |
現在張貼一個問題在DNA 克隆論壇! 得到幫助由點擊這裡 克隆您需要以下:
傳染媒介DNA 可能是:
需要是的傳染媒介或質粒DNA (
克隆您需要至少幾微克(3-5 或更多) 您的傳染媒介DNA 。
插入DNA 可能是:
Oligonucleotide 插入(oligos 與限制剪切一半站點鍛煉和磷酸化與PNK)
限制酵素被生成的插入
PCR 插入(PCR 與限制酵素剪切站點(整體站點是需要的!) 在底漆的’ 5 末端)
如果您想要克隆的插入是少於60 bp, 您能定□oligonucleotides 和一起鍛煉他們。
如果您的插入DNA 範圍小(少於1000 bp), 您理論上不需要同樣多DNA 像您的傳染媒介。如果您的插入DNA 範圍是微小的(10-200 bp), 您理論上需要很少這DNA 。
總之您應該有至少1 微克開始插入DNA 。
我們發現最容易的方式準備DNA 使用一個微型prep 工具箱(Qiagen) 。我們使用幾列為同樣傳染媒介DNA 構建。
為各列我們添加大約4 機器語言鎊增長的細菌(我們加2 機器語言鎊細菌湯來一支2 機器語言eppendorf 管和轉動兩次= 2 X 2 機器語言= 4 機器語言)
要訣: 總生長大約5 機器語言Lb.in. 15 機器語言獵鷹管, 保留□1 機器語言如同丙三醇細菌庫存凍結在 – 80 C 冷凍機。
怎麼做丙三醇細菌股票為 – 將保持幾年的80 C 冷凍機(您來從未將必須斑紋板材或再做能幹電池! – 保存您時間)
簡單添加50% 丙三醇來您的細菌增長鎊。這不必須是確切的ie 如果您被留下以大約1 機器語言細菌鎊添加大約500 uL 100% 丙三醇和凍結在 – 80 C 。
在洗脫各列以後以大約EB 50 uL (elution 緩衝, Qiagen, Tris 緩衝 – 不包含EDTA), 我們合併洗出液這樣, 我們有大約200 uL 到400 uL (或4 – 8 列每構建或傳染媒介) 。這是給足夠開始的傳染媒介DNA 為克隆。
注: 我們發現EDTA 在TE 禁止被洗脫的DNA 的隨後限制消化從微型prep 和其它質粒洗淨工具箱。
插入DNA 必須是
質粒傳染媒介通常被削減。
綁紮插入導航, 使用200 ng 傳染媒介作為指南(人們使用作為一點像50 ng – N.E.B 指南) 。
插入ng = 傳染媒介ng
插入範圍 傳染媒介範圍
所以綁紮500 bp 插入入您�&需要的5000 bp 傳染媒介
插入ng = 200 ng x 500
5000
插入ng = 20 ng 插入需要為1: 1 結紮術
為插入3: 您�&需要的1 傳染媒介結紮術: 60 ng
結紮術
x uL DNA 傳染媒介200 ng
Y uL 插入(被計算的ng)
2 uL 10 X 緩衝
1 uL T4 DNA 連接□NEB
對20 uL H20
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20 uL 總額
採取結紮術5 uL 和添加來DH 5 阿爾法電池Invitrogen 100 uL
(Subcloning 效率讚成, 一張被射擊的更好, 最大效率最好 – 為堅硬結紮術但昂貴) 。
加熱震動
添加SOC 250 uL 來能幹電池
鍍整個金額在板材。
生長overnite 在37 C
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