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Polyclonal 抗體相關外部資源- 協議:
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Polyclonal 抗體協議:
Polyclonal 抗體
Polyclonal 抗體 是抗體從許多B 電池或B 電池線路被派生, 相似與抗體混合物被查找在血液清液。
Polyclonal 抗體是因此許多不同的抗體特異性混合物。
Polyclonal 抗體準備被採購是許多不同的特異性抗體混合物對同樣抗原。
兔子、滑鼠、山羊、雞, 或其它動物的免役生產polyclonal 抗體。動物清液可能直接地被使用, 然而最好淨化polyclonal 抗體為實驗室用量。
Polyclonal 抗體準備
根據協議由大衛Bowtell 博士
滑鼠的免役:
射入使滑鼠免疫為polyclonal 抗體的生成應該使在間隔至少二個星期單獨。
以下2 輔藥成功:
- Freund 輔藥和MPL+TDM 輔藥(RIBI ImmunoChem Research, Inc.) 。MPL 比第一輔藥較不危害的。
- 為第一免役射入: 注射15 - 50 ug 如果抗原在200 ul 輔藥, 皮膚下地被注射。
- 第二射入應該以後發生2 個星期; 您必須然後提高以15 - 50 ug 抗原在輔藥。(如果時間允許, 再提高一月份以後) 。
- 七個到10 個日以後流血滑鼠和測試清液使用將被使用為審查的檢驗。如果滴定量不是足夠高, 提高再二個星期在早先提高以後。
頂層
清液準備:
- 在收集以後, 血液應該被允許凝結60 分鐘。在37.C 或O.N 在4.C 。
- 分離凝塊從管(敲響的) 邊使用pasteur 吸移管。安置凝塊在4.C O.N 。
- 轉動在10000 x g 10 min. 在4.C 分離清液。
- 清液可能被存儲在-20.C 在添加丙三醇以後來50% 。
如果monoclonal 抗體渴望, 一旦您安排一"好" polyclonal 和一個可靠的審查方法進行對下個步驟。
頂層
兔子:
兔子重要免疫如上所述。射入:
- 首先在Freund 的完全100-200ug/1ml 射入, 二個站點(在各肩膀) 。
- 其次1 月份以後在Freund 的未完成如上所述。
- 滲�&2 個星期以後。提高2 個星期以後再(2 個+ 2 個星期循環) 。
頂層
POLYCLONAL 抗體的生產在兔子(NEUSEELAND 白色)
根據協議由Dr.Walter 斯蒂芬。
兔子應該是3-4 公斤在重量和大約3 個月大。關於兔子三分之一有內在反角質素抗體和immunoactivity 為各種各樣的蜂窩電話要素。這強調採取前免疫清液的重要性從任一隻指定的兔子。
緩衝和解決方法:
- 飽和的氨鹽基sulfate 解決方法, 2 毫米EDTA,
酸鹼度8.0
- 50 毫米氨鹽基醋酸鹽, 酸鹼度8.0
- 70% 對氨基苯甲酸二
- Freund 的輔藥(完全& 未完成)
- 磷酸鹽緩衝的鹽(PBS) (參見下面)
- 凡士林
- 二甲苯
頂層
- 帶來兔子從其籠子和安全地安置它在一個克制的配件箱留下耳朵容易接近。相對地保留兔子安靜。血液的數量50 機器語言可能從主要動脈容易地被收集運行在耳朵的背部表面下的中心。
- 刮左耳朵在左靜脈附近與一個新鮮的剃鬚刀。
- 擦拭耳朵與70% 對氨基苯甲酸二或異丙醇。
- 擦拭耳朵與二甲苯在動脈靜脈循環附近膨脹。
- 暫掛耳朵(固定) 並且收集管的要訣在一隻手裡和與自由手插入19G 皮下針入膨脹的動脈。血液應該開始流立即入收集管。為最佳的結果使用動脈的部份中途沿耳朵。
- 收集50 機器語言血液。嚮問題的針項施加壓力先前對終止靈菌。
- 適用於凡士林耳朵安慰二甲苯激怒。
- 把額外凡士林放在剪切上。
獲得清液:
頂層
- 漩渦管以被收集的血液塗上表面和防止凝塊附件對管。
- 孵化在37 oC 1 個小時。
- 分離在2,500 g (設置#7 在臨床臺式) 10 分鐘。
- 去除凝塊和轉動清液在3,000 g 10 分鐘。
- 清液應該被存儲凍結。
氨鹽基IgG 的Sulfate 降雨雪從清液 (4 oC, 被執行在冷室):
氨鹽基sulfate 降雨雪是一個容易的方法獲得一個相當純淨的IgG 分數。
頂層
- 水池清液從一隻兔子
- 重量清液
W1 = _____ g
- 洗滌管以分鐘。PBS 和再稱。
W2 = _____ g
- 添加W2 飽和的氨鹽基sulfate, 2 毫米EDTA, 酸鹼度8.0 的2/3 數量
注: 添加非常慢慢地, dropwise 當攪動在4 oC 或使用蠕動的泵浦。
- 攪動15 分鐘。
- 調用到40 機器語言離心機管; 洗滌燒杯以3 份PBS: 2 份氨鹽基sulfate 和添加來管。
- 旋轉在12,000 g (Beckman JA-20: 10,000 轉每分鐘) 10 分鐘。
- 放棄上層清液。
- 重新懸掛藥丸在PBS [ 1/2 W1 = 1/2 卷。] 。
- 轉動在12,000 g 10 分鐘, 放棄藥丸。
- 收集上層清液在燒杯, 洗滌牆壁裡與PBS 。
確定W3 = _____
- 添加2/3 卷。W3 飽和的氨鹽基sulfate, 當攪動。持續攪動15 分鐘。
- 調用暫掛到40 機器語言離心機管, 洗滌管用PBS/ammonium sulfate 解決方法。
- 轉動在12,000 g 10 分鐘。
- 放棄上層清液。
- 重新懸掛藥丸在1/4 W1 PBS 。
- 滲析反對PBS, 3 時間6 時數每。
- 投入清液在一支畢業的管, 沖洗透析袋子很好與PBS 。
- 帶來1/2 W1 = 1/2 卷在PBS 。
- 確定蛋白質含量和整除數為存貯。評定吸收在280 毫微米。1 個mg/ml IgG 解決方法的吸收是大約1.5 。
免役:
頂層
- 溶化~400-600 g 抗原(~200-300 g 每射入) 在2.2 機器語言50 毫米氨鹽基醋酸鹽, 酸鹼度8.0 或其他適當的緩衝。濃度取決於蛋白質抗原性被注射。
- 數量抗原必要使動物免疫取決於它抗原性和免役方法。如果蛋白質以低抗原性被使用, 它將是有用弈質蛋白質以SDS (0.2% 的) 低濃度。唯一高度被淨化的抗原應該被使用為polyclonal 抗體的生產。一個容易的方法獲得純淨的抗原是由SDS-PAGE 。蛋白質可能調用到硝化纖維素板料, 被弄髒與Ponceau S, 被刪去與剃鬚刀, 和被使用作為抗原(尋找標準協議在SDS-PAGE) 。
- 勾畫1.1.ml Freund 的完全輔藥與20G 皮下針,
那麼勾畫1.1 機器語言抗原解決方法。凍結剩餘1.1 機器語言為提高。
- 保持柱塞固定, 去除針和附有一個不�&的三通的止流栓。
- 與輔藥混合抗原由附有第二個玻璃注射器止流栓和注射反覆。(小心: 一些塑料注射器也許起反應與礦物油。)
- 完全乳化液將被形成在大約20-30 分鐘以後; 由在解決方法的黏度的一個相當突然的增量表明。
小心: 請務必, 架置是安全!
- 在混合的等待以後大約20 分鐘在射入之前對控制, 混合物是完全的(如果未完成, 油將分離) 。
- 刮兔子從肩胛骨到骨盆。
- 清洗與70% 對氨基苯甲酸二或異丙醇
- 注射在皮膚之下入大約10-20 邊沿脊椎在肩胛骨和骨盆之間使用21G 皮下針。(附註: 第一射入一個星期在前preimmune 靈菌以後) 。
- 等待一月份和提高與抗原和未完成輔藥混合物。避免傷痕從早先射入。
- 流血在一個星期以後檢查免疫回應。提高應該被重複, 如果免疫反應是太微弱的; 但是, 一隻另外兔子應該被選擇, 如果兔子沒有起反應根本/LI >
參考: Garvey 、J.S. 、Cremer 、N.E., & Sussdorf, D.H. (1977) 在: 方法在免疫學方面。客棧。Benjamin/Cummings Publishing Company 。讀取質量。頁545
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Polyclonal 抗體審查使用ELISA 檢驗
ELISA 協議為抗體屏幕:
材料為ELISA:
. 板材- 96 井Dynatech Immulon, 型2 。(Fisher 17-0221-199) 。
. PBS, TBS
. PBS + 0.1% 非離子活性劑20 或TBS + 0.1% 非離子活性劑20 。
. 阻攔解決方法= 2% BSA (型V) 在PBS 。(添加0.02% 迭氮為長期儲備。)
. Elisa 緩衝= 2% BSA + 0.1% 非離子活性劑20 在PBS (迭氮選項) 。
. 酵素被鏈接的抗體= 辣根peroxidase 1
. 基體= ABTS - 100X (從Zymed 00-2001)1
. HRP 緩衝: 100mM Na 枸櫞酸鹽酸鹼度4.2(490 毫克檸檬酸+ 720 毫克Na 枸櫞酸鹽
二水合物+ 50 機器語言H2.O, 酸鹼度4.2) 。
. 過氧化+ 30% (1000X)
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ELISA 協議為Polyclonal 抗體
1) 抗原的ADSORBTION
a) 稀釋Ag 對10 ug/ml 在PBS 。
b) 添加Ag 解決方法100 ul 來每個很好。
c) 留下O.N 用薩冉樹脂換行被蓋, 在4.C 。
2) 阻攔
a) 洗滌未捆綁的Ag 由倒置板材和甩井烘乾。
b) 沖洗由再添加PBS 來每個井和倒置它(用途噴瓶) 。
c) 重複沖洗兩次。
d) 添加阻攔解決方法100 ul 來每很好, 留下1 時數在室臨時或O.N 在4.C 。
3) 主要抗體
a) 添加抗體被測試:
電池Sup = 25 ul, 混合很好由上上下下pipeting (10 次) 。
清液、腹水= 1:100 和serie 1/5 稀釋。做稀釋在阻攔解決方法。
b) 留下1 時數在室臨時或O.N 在4.C 。
4) 附屬抗體
a) 洗滌未捆綁的抗體4 次與PBS + 0.1% 非離子活性劑20 。
b) 添加酵素被鏈接的抗體100 ul 來所有井。做適當的稀釋在Elisa 緩衝。(前: HRP 是2000X) 。
c) 留下1 時數在室臨時或O.N 在4.C 。
5) 基體
a) Disolve 基體在水中。
b) 洗滌板材4 次與PBS + 0.1% 非離子活性劑20 (用途TBS 代替PBS 為AP) 。
c) 添加基體100 ul 來每口井。
d) 觀望顏色發展。這能採取從幾第二（個）對20 分鐘。
e) 如果需要, 終止回應由添加4M NaOH 50 ul 。
f) 讀吸收在Elisa 閱讀程式在正確波長(為HRP 系統416 毫微米, 為AP - 405 毫微米) 。
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