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科学的了不起的人工是至尊艺术家。~Martin H. Fischer
获得高质量, 原封核糖核酸是一并且最重要的步骤在执行许多根本分子生物学经常试验, 包括北分析、核酸酶保护检验、RT-PCR 、核糖核酸映射, 体外转换和DNA 图书馆建筑。成功, 然而, 核糖核酸隔离程序应该包括一些重要步骤两个在实际核糖核酸洗净前后。
根据核糖核酸被提取, 有允许它与其它蜂窝电话材料被隔绝譬如蛋白质、DNA 和甚而油脂核糖核酸的属性。
信使核糖核酸或mRNA 包含舒展腺苷残滓以poly(A) 尾巴的形式。这被剥削允许mRNA 一定对poly(T) 亲合力列或小珠。
如果您当前有一个更喜欢的方法为隔绝核糖核酸, 继续使用它。
如果您未隔绝核糖核酸从您的系统在和您的有机体不是在以下列表之前, 我们能帮助您辨认被使用了为隔绝核糖核酸为北弄脏或RT-PCR 从您的系统的被设立的协议。这些类型协议并且将产生"microarray 级别" 核糖核酸。
总运行您的核糖核酸agarose 胶凝体估计质量。
注: 如果您使用一种非列基于的洗净试剂譬如我们推荐您沉淀您的核糖核酸第二次从对氨基苯甲酸二或的TRIzol 您通过它通过Rneasy 列或相似的设备。这保险所有有机污染物撤除(参见光谱下面) 。
高效率的nuclear/cytoplasmic 分馏可能由弈质的agarose 胶凝体分析快速估计(参见图1) 。范围对应于前体rRNA 应该是等效的在总和核核糖核酸分数。18S 和28S rRNA 范围将是较不强烈的在核核糖核酸分数比在或总额核糖核酸或细胞质分数核糖核酸里。在一些电池线路, 例如293 和COS-7 电池, 这差额将是剧烈的, 但在其它电池线路譬如海拉电池, rRNA 范围是少许较不强烈的在核核糖核酸里比在总或细胞质分数核糖核酸里。"
A260 读取和260/280 比率不是足够保证高纯度核糖核酸。您必须采取一个充分的紫外光谱。下面是所有有好260/280 比率的3 个实例光谱, 但有非常不同的纯净。您能并且使用260/230 比率对帮助确定相当数量有机污秽在您的核糖核酸里。这比260/280 比率是一个更加可变的编号, 但常规, 比率在1 之上表明好纯净。
电池然后被洗涤了在PBS 和连续地提取了如所描述。首先, 电池被提取了以Nonidet P-40 缓冲(10 毫米Tris Cl, (酸碱度7.5), 10 毫米NaCl, 3 毫米氯化镁, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 毫米DTT) 。残余的药丸(粗砺的内质蜂巢胃(RER) 并且中坚力量) 被洗涤了在同样缓冲和被提取了在缓冲B (10 毫米Tris Cl (酸碱度7.5), 10 毫米NaCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 毫米EDTA, 40 units/ml Rnasin, 1 毫米DTT) 。残余的核药丸被洗涤了在同样缓冲和被提取了以高盐缓冲(10 毫米Tris Cl (酸碱度7.5), 0.5 M NaCl, 3 毫米氯化镁, 0.5%(v/v) Nonidet P-40 、40 units/ml Rnasin, 1 毫米DTT) 。核糖核酸被净化了从各个分数由核糖核酸STAT 解决方法。总核糖核酸被隔绝了使用RNA-STAT60 试剂(电话测试) 根据指令由制造商提供。(参考: Byeong-Churl Jang 等, 2002)
为100 mls 200 mls
4 。5M Guanidinium 硫氰酸53.2 g 106.4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM EDTA 0.5M 10 mls 20 mls 25mM Tris-HCl, 酸碱度7.5 1M 2.5 mls 5 mls
0 。1M b 巯基乙醇700ul 1.4mls
0 。2% antifoam A (斯格码) 200 ul 400 ul
5 。7 M CsCl 坐垫* 最终数量100 机器语言
5 。7 M "被烘烤的" CsCl 95.8g
0 。1M EDTA 0.5M 20 mls
* 使用DEPC 被对待的水和被烘烤的玻璃器皿。这个解决方法必须任意正, 绝对, 是核糖核酸酶。核糖核酸酶是到处! 佩带手套、用途唯一被烘烤的玻璃器皿, 或处女塑料。DePC 款待您的水, 缓冲(除了Tris) 。非常小心。
1 。称动物。去除器官(肝脏), 衡量DNA 的当中一个优越属性是您减少基因复杂由选择只表达multilocus 酵素的一个唯一所在地的器官。2 。迅速地使组织均匀在"纷乱" 缓冲(9mls) 3 。转动homogenant 在12 公斤取消不能溶解的物料4 。当Homogenant 转动4.A 。称重1.8 g CsCl (0.2g/ml) 每范例。4B 。在高速离心器管("快速密封") 添加3.5mls 5.7M CsCl "坐垫" 这块层必须任意是核糖核酸酶。您将分离您的核糖核酸通过这块层并且任一污秽将导致重大损失。5 。去除supernant, 投入入新鲜的管, 加1.8 g CsCl 6 。仔细地, 添加homogenant 在CsCl 坐垫顶部。这是欣然成功的由使用10cc 注射器和长式针。安置needle/syringe 入快速密封管, 和添加组织homogenant 来注射器。Homogenant 慢慢地将滴下入Q-S 管, 浮动在坐垫顶部。
7 。仔细地, 平衡被符合的成对离心机管(+ 0.005 g) 。
8 。密封管、安排被符合的管对面彼此和盖帽以红色铝顶层。
9 。离心机, 50,000 rpms 5.5 时数, 20oC
在离心法以后: 标记药丸应该是的管: 在底下外面边(相对电动子的中心)
10 。去除管, 安置在方便机架里。
11 。切tube.Aspirate 顶层名列前茅2/3- 3/4 解决方法。工作从顶层下来。它重要, 您首先吐气较大多数解决方法和去除所有除了清楚的坐垫。不要吐气无形的药丸在底层。
12 。切除管的名列前茅2/3 。使用"被拉扯的" Pasteur 吸取, 仔细地去除剩余解决方法。药丸将是在管的底层边。
13 。漂洗药丸与70% EtOH, 去除(用途Pasteur 吸取), 重复得两次(总额3 洗涤)
14 。添加0.1x TE (核糖核酸酶200 ul 自由), 使用吸取要诀来易碎药丸和"滴定" T.E. 企图投入药丸入解决方法。至少形成一个异种解决方法和投入入一支新鲜的microfuge 管。
15 。重复以T.E. 200 ul 合并两个解决方法
16 。漩涡, 好核糖核酸不喜欢进入解决方法。耐心是贤良。
17 。确定浓度, 10 ul 入490 ul (500 ul 最终卷)
18 。取消1 到2 ug 核糖核酸为胶凝体分析(添加核糖核酸装载缓冲)
19 。任意添加1/10 数量核糖核酸酶3M NaOAC (40 ul), EtOH 的2.5 数量(1.0ml) 。混合苍劲。
20 。您能计算核糖核酸的浓度在EtOH.Thus, 那里是没有需要立即沉淀所有您的核糖核酸。取消大约1.5 到2 倍您需要由vortexing EtOH/RNA 解决方法的金额并且请取消适当的数量。这个EtOH/RNA 解决方法被存储在20oC 或降下, 是稳定几年来。
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