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北污点

版权2007 年- 分子岗位

音像 倾听一个详细的北污点解释!

北弄脏的历史记录

北弄脏是1977 年被开发由Alwine 等在斯坦福大学的核糖核酸弄脏的技术(ref:1) 。它命名以 弄脏为 DNA 的南部的污点技术, 1975 年由Edwin M. Southern 发明。 西部污点, 1981 年一个方法为弄脏为蛋白质并且是戏剧在南部的污点命名和被命名了(ref:2) 。

背景信息- 北污点技术

北分析尽管其年龄在实时PCR 、核酸酶保护检验(RPAs) 并且microarrays 高技术世界, 是仍然金子标准为mRNA 级别的检测和测量。这是因为北污点分析允许信使核糖核酸丰盈的一个直接比较在范例之间在一个唯一膜。

在北污点主要差额在其它弄脏的技术之间是, 核糖核酸是系数被检测。并且, 由于这样的事实核糖核酸通常唯一搁浅, 它创建影响其迁移并且因此弈质情况被使用运行胶凝体的复杂附属结构(不同于南部) 。

核糖核酸由RNA 胶凝体 电泳法(通常 agarose 胶凝体电泳法), 随后调用到膜, 杂交以探针, 和最终检测分离。

 

 

同样与南部弄脏, 杂交探针也许是DNA 或核糖核酸在北弄脏。

程序的变形以反向北污点著名(虽然, 少有地) 偶尔地被使用了。在这个程序, 被添加膜) 是被隔绝的DNA 片段的一件收藏品的基体核酸(, 和探针是核糖核酸从组织被提取和放射性地被标记。

对进入了普遍用途在90 年代和早期的2000s 晚期的DNA microarrays 的用途是如同对反向程序, 他们介入对被隔绝的DNA 片段的用途被添加基体, 和杂交以探针由蜂窝电话核糖核酸被做。因而反向程序, 虽然原始不凡, 被启用基因表达的一在时间研究使用北分析转变成基因表达描出, 许多(可能所有) 基因在有机体也许有他们的表达式被监控

北污点的申请

北污点是superceded 在多数面积由实时PCR 和microarray 途径。它经常不被使用为临床或诊断目的。

北污点协议和其差异被使用然而在分子生物学研究:

• 一金子标准为基因表达的直接研究在mRNA (信使核糖核酸抄本的) 级别。
• mRNA 抄本范围的检测
• 研究核糖核酸退化
• 研究核糖核酸接合- 能检测替代被接合的抄本
• 学习核糖核酸半衰期
• 研究怒火(内部ribosomal 项站点) - 去除核糖核酸消化的可能性对第2 个cistron 转换。
• 经常过去经常证实和检查transgenic/击倒鼠标(动物)

不利北弄脏

不利使用北弄脏有:

• 经常放射线被使用。这防止执行它, 用途和处理舒适。非放射性的检测新建方法被生成了允许非放射性的检测。参见皮尔斯。
• 北弄脏的整体进程通常需要久时间, 从范例准备通过对检测。
• 如果核糖核酸范例是均匀的由RNases 轻微地贬低, 表达式的数据和测量的质量是相当负受影响的。
• 标准北污点方法比核酸酶保护检验和RT-PCR 相对地较不敏感的。北污点敏感性也许被增加以对尼龙positively-charged 膜的用途, 对一根高特定antisense 探针的用途。
• 检测以多根探针是问题。经常, 膜必须被剥离在杂交和检测之前以第二根探针。这是问题因为苛刻的情况必需从污点剥离探针和还费时。并且, 有限额对污点也许被剥离的时间。

好处北弄脏

北污点好处有:

• 这是一个广泛被接受的和很好被看待的方法
• 北弄脏是一个直接的方法
• 经常它被使用作为确认书或支票
• 经常金子标准
• 这是一个多才多艺的协议因为它可能允许许多类型用量探针(对实时PCR) 有: radiolabeled 和非radiolabeled, 体外被抄录的核糖核酸和甚而低聚核苷酸譬如底漆。
• 顺序以甚而部分同源, 不同于实时PCR 或其它方法可能被使用当杂交探针(即顺序从另外种类为同源分析, 甚至genomic 片段可能被使用) 。

北污点协议

如同提及步骤在北弄脏有:

1. 核糖核酸隔离
2. 核糖核酸胶凝体电泳法为分离
3. 调用到膜(通常positively-charged 尼龙作为核糖核酸negatively-charged)
4. 核糖核酸Cross-linking 对膜(通常通过紫外交互相联或化学制品平均值)
5. 杂交
6. 检测

材料需要为北污点协议

缓冲食谱

20XSSPE (500 机器语言)

• 3.6M NaCl: 105.2 g
• 0 。2M 磷酸盐缓冲酸碱度7.0: 1M 100mL
• 20mM EDTA: 20mL 0.5M

磷酸盐缓冲pH7.0 (500ml)

• NaH2PO4 (一价的) 140 机器语言1M
• Na2H2PO4 (二元) 360 机器语言1M
• 酸碱度到7.0 在两个以后被添加

杂交缓冲= HB (100mls)

• 5X SSPE: 25mls 20X
• 2% SDS: 20 mls 10%

 

* * 正确使用任意以前添加1000ug 被弈质的核糖核酸酶CT DNA (热对95.o 3 分钟弈质) 5000ug 酵母核糖核酸

 

洗涤: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls 20X 5 mls 10% SDS = 0.1% SDS

连续缓冲为核糖核酸胶凝体(1L)

• 100 mls 10X 擦
• 52 。甲醛6 mls
• 847 。4 mls H20

核糖核酸胶凝体(70ml)

• 0.84 g agarose
• 7 mls 10x 擦
• 58.38 mls H2.O
• 投入胶凝体在解决方法由热化。让胶凝体冷静对60.C, 然后添加甲醛来等于0.66M -- 3.78 mls
• 倾吐胶凝体在发烟敞篷里如果可能

核糖核酸范例为北污点

参见 核糖核酸隔离和洗净

核糖核酸胶凝体

在隔绝核糖核酸以后, 核糖核酸必须被分离在胶凝体(通常agarose) 。

参见 核糖核酸胶凝体

北污点调用到尼龙膜协议

在运行 核糖核酸胶凝体以后, 洗涤胶凝体与蒸馏水把放在posiblotter 上。

层从顶向下是:

• 海绵
• 3-4 Whatman 纸剪切对范围(这两上述应该被浸泡在10X SSPE 但不滴下)
• 胶凝体屏蔽。
• 注: 确定胶凝体重叠屏蔽以便它可能密封膜以胶凝体顶层的线路并且正确的顶面角落标记了3 个片断轻微地更大的3M 纸坚硬塑料以漏洞

钳位和确定有一个好密封。使用75-80 毫米百克压力1 个小时或更多。

弄脏膜干燥

Cross-linking 尼龙膜- 北污点协议

• 剪切右上角换行在萨冉树脂换行里。
• 紫外照耀以核糖核酸边下来2.5 分钟。
• 洗涤两三分钟在热的2X SSPE/0.1% SDS 解决方法(微波解决方法30-45 秒在50% 力量。
• 宣扬干燥

前杂交为北污点

1. 前杂交6 时数隔夜
2. 设置烤箱对65.C 热HB 缓冲投入SDS 在解决方法
3. 滚动膜在滤网里面片断和投入入hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS)
4. 检查气泡
5. 投入管在烤箱被平衡与其它管在反面

标记的探针为北弄脏

1. 投入探针25ng 在11uL 的一个总数量与ddH2.O
2. 弈质@ 95.C 3 分钟。这将得到探针唯一搁浅和去除会防止高效率的杂交的附属结构。
3. 快冷却在湿冰。这将保留探针唯一搁浅, 免于附属结构和不允许reannealing (或改革附属结构) 。
4. 添加4.ul 高头等(Boehringer 曼海姆) 5.ul 阿尔法radiolabeled P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul 总额
5. 孵化10-15 极小的37.C
6. 添加1X TE, 2.ul 0.5M EDTA 28uL, 来20ul 回应。
7. 前转动G-25 Sephadex 列为1 分钟。
8. 添加50ul 范例来列和转动2.5 分钟在临床离心机。这将净化探针从标签。
9. 投掷列。
10. 混合在新建管100ug CT-DNA 50ug 酵母核糖核酸在0.5mL 管。
11. 弈质95. 3 分钟
12. 添加来杂种管混合, 杂交在65.C 20-36 时数

张贴杂交协议为北弄脏

杂交36-48 时数然后洗涤。

1. 加热2X SSPE/0.1% SDS (洗涤) 热由65. C 决定(用途微波或热水锅温暖解决方法)
2. 去掉管和倾吐液体入热的放射性废物容器。
3. 冲洗以10ml 洗涤做这两次和倾吐废物。
4. vigoursly 投入在洗涤和震动40 到50 mls 。
5. 投入在杂交烤箱为20 极小转动。
6. 倾吐在水槽下
7. 其他40-50mls 和震动在烤箱。
8. 倾吐到废容器(水槽如果不热或含毒物) 并且确定天气不再热的和然后去掉膜。
9. 洗涤在振动器与0.2XSSPE 以0.1% SDS 在RT 15 分钟。
10. 宣扬干燥
11. 曝光

 

要诀为北污点

如果您当前有一个更喜欢的方法为隔绝核糖核酸, 继续使用它。

总运行您的核糖核酸agarose 胶凝体估计质量。不仅依靠分光光度学结果。

* 使用DEPC 被对待的水和被烘烤的玻璃器皿。这个解决方法必须任意正, 绝对, 是核糖核酸酶。核糖核酸酶是到处! 佩带手套、用途唯一被烘烤的玻璃器皿, 或处女塑料。DePC 款待您的水, 缓冲(除了Tris) 。非常小心。

 

解决困难的北污点

如果您当前有一个更喜欢的方法为隔绝核糖核酸, 继续使用它。

 

讨论和张贴问题对此在 北污点论坛。

北污点参考

1. Alwine JC, Kemp DJ, 纯然的GR (1977) 。"方法为特定RNAs 的检测在agarose 形成胶冻由调用到diazobenzyloxymethyl 纸并且杂交与DNA 探查" 。Proc 。全国。Acad 。Sci 。美国。74 (12): 5350-4 。
2. W. Neal Burnette (1981 4月) 。"' 西部弄脏': 蛋白质从钠dodecyl sulfate 聚丙烯酰胺胶凝体到 — 非限定的硝化纤维素和幅射线照相的检测电泳调用与抗体和radioiodinated 蛋白质A "。肛门Biochem 112 (2): 195-203 。