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参见: 外部站点的相关连结: 西部污点

西部污点

音像: 倾听一个详细的西部污点解释! 礼貌: 全国人的染色体研究所。

西部污点定义: 西部弄脏是技术使用辨认和找出蛋白质根据他们的能力束缚对特定抗体。

   西部污点分析可能检测您的蛋白质利益从很大数量的蛋白质混合物。  西部弄脏可能提供您关于您的蛋白质的范围的信息(以与一架范围标记的比较或梯子在kDa), 和并且提供您信息关于蛋白质表达式(以与一个控制的比较譬如未经治疗的范例或其他电池类型或组织) 。 

汇总: 西部污点提供您信息关于:

您的蛋白质的范围

表达式相当数量您的蛋白质

西部污点分析可能分析任一个蛋白质范例是否从电池或组织, 而且能分析再组合蛋白质被综合在试管内。 西部污点依靠您过去常探查为您的蛋白质利益抗体的质量, 和怎么特定它是为这蛋白质。 抗体容易地现在是可获得的从商业来源, 并且您能采购一为您的蛋白质利益。如果您的蛋白质是新颖的蛋白质, 您必须生产抗体你自己或使公司做它为您。您在这种情况下将需要至少小量您的蛋白质或被净化从电池解压缩或被做作为再组合(ie 体外或在一个 再组合蛋白质表达式系统) 。   抗体特定对您的蛋白质对西部弄脏是重要的因为他们能特定束缚对您的蛋白质利益代替千位蛋白质在您的西部污点!

图1 。步骤的详细资料被介入在获得蛋白质为西部污点。

 图2 。图选派步骤在举办西部污点。

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西部弄脏怎么运作?

参见 绘制1 下面。重要的事先来。获得您想要分析的蛋白质范例, 譬如电池范例。溶解电池发行蛋白质含量。运行这些在分离蛋白质根据范围的胶凝体。然后调用这些胶凝体蛋白质一个膜使用电。这个膜可能然后被使用探查为蛋白质利益使用主要抗体。

什么您需要西部污点:

蛋白质范例

好抗体检测您的蛋白质利益

西部污点依靠主要抗体检测这蛋白质从千位蛋白质在您的膜和早先在您的胶凝体! (电池可能包含30,000 不同蛋白质- 并且这些同样蛋白质可能甚而被修改给您300,000 不同蛋白质!) 。使用抗体认可您的主要抗体(附属抗体) 您加强蛋白质抗体抗体三明治!  附属抗体有转换luminol 基体成一种轻的发行的物质的马萝卜过氧化物酶酵素! 这光被检测作为一个地点在影片。从这个地点您能确定多少蛋白质是那里相对其它地点, 或蛋白质的范围相对并且运行在胶凝体的范围标记。

绘制2 显示西部污点实例胶凝体。运输路线1 是显示蛋白质的不同的已知的范围的 蛋白质 范围标记梯子, 这可能商业被采购并且所有地点的范围被测量在小册子。运输路线3 是癌症范例并且运输路线5 是一个正常范例。如同您能看蛋白质在运输路线3 比癌症范例有一个更高的表达式在运输路线5, 是有趣。并且, 蛋白质地点在运输路线3 和5 是作为第2 个地点在范围梯子从运输路线1 的相同大小。我们能然后看已知的蛋白质范围从我们接受与梯子的我们的小册子。我们然后确定, 蛋白质的范围是80 kDa 。我们的蛋白质利益并且是80 kDa 。如此我们知道, 西部污点运作并且蛋白质用癌症范例高被表达!

检测您的蛋白质:

采购抗体反对您的主要抗体来源

使用ECL - 化合光工具箱和影片取得结果

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绘制1 。                                                                                                                                      绘制2 。

现在学会一切那里是关于西部污点!

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目录, 在有条有理完成为西部污点:

步骤在西部弄脏:

- 为西部污点做准备

- 抗体使用为西部污点

- 溶解电池为西部污点

- SDS-PAGE 胶凝体信息

- SDS-PAGE 胶凝体准备为西部污点

- 胶凝体电泳法- 运行胶凝体

- 蛋白质Tranfer 对膜为西部弄脏

- 西部污点

用语和定义被使用在西部污点分析

最新的 西部污点事宜!

 

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步骤在西部污点分析:

- 范例Prepartation

- 溶解缓冲

- 抗体

- 溶解电池

- 胶凝体准备

- 运行的胶凝体

- 胶凝体调用

- 控制

- 西部污点

- 读出

- 分析和解释

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范例为西部污点做准备:

是否您有非依附电池(譬如T 电池线路或外围血细胞) 或依附电池(譬如成纤维细胞电池或COS 电池), 您需要从媒体取消局外蛋白质。为非依附电池您能柔和地射击他们以离心法和然后洗涤药丸与PBS 。为依附电池、简单洗涤烧瓶或盘与PBS 在西部污点之前。

 

西部污点分析审查蛋白质, 和因此我们要蛋白质是释放从电池和并且防止蛋白质由蛋白酶被剪切。我们需要这些对西部污点:

- 保持事冷! 4C 在冰在电池病势渐退期间为西部弄脏

- 使用洗涤剂破坏电池的膜发行蛋白质

- 缓冲

- 抗化剂(蛋白酶抗化剂和磷酸酶抗化剂如果我们将做西部污点为磷蛋白质)

 

洗涤剂- 溶解电池为西部污点

SDS 和RIPA 是被使用溶解蛋白质为最新分析使用西部弄脏的洗涤剂。这必需许多蛋白质是或在电池或被找出的里面细胞膜里面, 因此我们需要发行这些蛋白质能对immunoblot 为他们。

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哪抗体我应该使用为西部弄脏?

您应该选择抗体使用为西部污点。 通常或鼠标monoclonal 抗体或兔子polyclonal 抗体被使用。

您能使用或者抗体没有任何被添加的组, 或使用被共轭对生物素的抗体。这些抗体不要求

 

Polyclonal 对Monoclonal 抗体为西部污点

Monoclonal 抗体 通常是好为西部弄脏由于:

- 更好的针对噪音的信号比率(更低的背景在西部污点)

- 他们的更高的特异性(您得到较少沾染的蛋白质或Ig)

- 整体擦净剂结果在西部弄脏的影片(较不未指明的范围被检测)

 

Polyclonal 抗体 更好适用与Immunoprecipitation:

- 他们认可更多epitopes

- 有更高的欲望

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溶解电池为西部污点:

要诀在您之前溶解为西部弄脏:

如果您去西部污点为蛋白质质量 (ie 不是磷酸化的) 的蛋白质:

- 您能溶解在更大的数量(保留休息弄脏为其它蛋白质)

 

如果您去西部污点磷蛋白质 (或磷酸化的蛋白质) 它重要做以下:

- 确定您用途磷酸酶抗化剂(譬如vanadate 因为磷酸酶从您的蛋白质将取消磷酸盐! )

- 并且溶解电池在最小的数量可能(ie 溶解在100 ul 装载缓冲, 这做因为您能装载您溶解的大多电池。这重要虽然信号相当微弱的当西部弄脏为磷蛋白质。)

 

如果您看蛋白质蛋白质交往:

- 不要使用SDS 如同它离解蛋白质蛋白质交往并且蛋白质因而被弈质(特别是在煮沸以后)

- 为西部弄脏的蛋白质蛋白质交往, ie 当地交往您必须使用一种严密洗涤剂这样的RIPA 。

 

溶解:

- 能做直接地在板材或盘

- 射击电池

- 保持在冰和寒冷- 使用一个冰桶

- 经验法则使多少病势渐退缓冲使用是: 10^5 病势渐退缓冲电池/uL

- 收集在eppendorf 管和标签(保留这些在冰)

 

评定总蛋白含量在西部污点分析之前:

- 这允许定量分析如果您想要比较处理条件在西部污点分析

- 商业工具箱是可利用的譬如布雷得佛检验为评定总蛋白含量(从生物随机存取磁盘)

- 0.1% SDS 或更加伟大的罐头干涉蛋白质评定

 

弈质蛋白质范例:

- 添加蛋白质装载范例缓冲来整除数电池lysate - 包含染料(太看迁移在胶凝体, 2% SDS)

- 添加二硫化物脱氧剂譬如beta - 巯基乙醇

- 煮沸在热水锅或热化块(低温譬如中间- 90 度减少蛋白质汇总) 。

- 戳一个漏洞在各支管里盖帽防止流行

 

SDS-PAGE 胶凝体信息为西部弄脏

SDS-PAGE 胶凝体是由范围使用分离蛋白质在电流面前的胶凝体矩阵。低百分比胶凝体分离更大的蛋白质但是更高的百分比胶凝体分离更小的蛋白质更好。问题是, 所有蛋白质有被充电伴生与他们, 并且在电流这能造成问题。这由SDS 的添加解决对蛋白质范例。SDS 束缚对蛋白质每少量氨基酸和中立化蛋白质有的充电差额。这允许蛋白质不是由充电分离由范围和。

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SDS-PAGE 胶凝体准备为西部污点

- 根据多少蛋白质您将想要装载为西部弄脏, 您应该使用小梳子或更大的梳子。

- 丙烯酰胺的百分比重要。通常10% 丙烯酰胺被使用。

- 一个解决的胶凝体被使用在底层以酸碱度8.8

- 一个堆积的胶凝体(4-5%) 酸碱度6.8 被使用包装蛋白质一起在装载以后

- 胶凝体的聚化被加速聚化回应的催化剂增加APS 和TEMED (形成和固体化) 聚丙烯酰胺胶凝体。

- 仔细地装载每个范例和慢慢地防止范例漏在运输路线外面。

- 装载每个运输路线和使用范例缓冲在每个(防止差额) 。

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形成胶冻电泳法

1. 分离范例为10 秒数在煮沸以后。
2. 装载范例入各个运输路线
3. 装载兆瓦参考
4. 运行胶凝体在100V (恒定的电压) 甚至改善在40 mA (恒定的当前) 。观看蛋白质marker/ladder 或洗染前线使何时终止胶凝体。恒定的当前给更好和更加急剧的结果如果您有时间。

- 手表为泡影在玻璃之间和在胶凝体之下- 这意味这有效

- 手表为蛋白质迁移(应该下来) - 如果不是您切换了销售线索, 能丢失所有您的范例!

- 慢慢地首字母运行通过堆积的胶凝体(~ 50 伏特), 这给更加锋利的范围。

- 隔夜不要运行

- 不要过度加热胶凝体(这导致胶凝体丢失坚硬, 导致贫寒resoloving 和模糊的非常被形成的范围)

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蛋白质Tranfer 对膜为西部弄脏

选择膜类型:

能使用或者:

- PVDF 膜为西部污点

- 硝化纤维素膜为西部污点

- 尼龙膜(现在很少被使用- 能撕毁)

 

要诀为Transfering 对西部膜:

- 穿戴手套一直! 使用镊子

- 使touching/forceps 减到最小对膜

 

生物随机存取磁盘转帐单:

(-)
海绵在黑色
滤纸
胶凝体硝化纤维素
滤纸
海绵
(+)

调用 :

- 保留冷静在4C

- 调用隔夜在35 V

- 能快速调用在1 时数在更高的V

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西部污点

阻拦膜 允许您最大化signal:noise 比率

- 穿戴手套

- 块与5% Blotto (无脂肪牛奶粉- 粉末) 或1 - 5% BSA (迟钝的清液白蛋白) 为磷酸化的蛋白质。

- 缓冲是TBST

洗涤在阻拦以后

- 洗涤在阻拦步骤以后不重要, 因为人经常块在主要抗体孵出期间。

- 洗涤物通常完成以TBST 缓冲。能快速做以TBST 的一个大数量。

孵出与主要抗体

- 鼠标、兔子或其它种类

- 通常1: 1000 年稀释与TBST

- 如果高background/many 未指明的范围是问题, 孵出可能完成与5% BSA 或牛奶。

洗涤在主要抗体以后

- 不那么重要

- 能快速洗涤以TBST 的大数量

附属抗体的孵出

- 通常被稀释的1: 10, 000 与TBST

- 反鼠标、反兔子, 或其它抗体被共轭与HRP 酵素为检测

洗涤在附属抗体以后

- 重要

- 洗涤5 X 5 分钟与TBST 。

- 如果您必须真正地冲, 洗涤至少3 次以TBST 的更大的数量。

检验为结果

- ECL (改进的化合光) 通常被使用

- 影片被暴露和被开发。风险10 秒是足够通常为总蛋白含量。磷蛋白质可能要求2 个- 20 个周详风险。

- 影片通常是XOMAT 或相似的' 快速的' 影片

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参见 排错西部污点

用语被使用在西部弄脏:

WB - 西部污点

IB - immunoblot (其它术语为西部弄脏)

SDS - 钠Dodecyl Sulfate (洗涤剂被使用在许多西部弄脏的解决方法)

页- Polyacrilamide 胶凝体电泳法

Ab - 抗体(抗体被使用检测您的蛋白质利益)

HRP - 马萝卜过氧化物酶

Luminol - HRP 劈开导致轻的形成的基体

ECL - 改进的化合光(提高轻的形成HRP + Luminol) 的西部污点解决方法

kD/kDa - kilodalton (多数蛋白质平均数在30 之间- 80 kDa)

RAM - 兔子反鼠标Ig

Ig - Immunoglobulin(an 抗体isotype)

NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - phenylmethylsulfonyl 氟化物

BSA - 迟钝的清液白蛋白

NFDM - 无脂肪牛奶粉

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