西部污点

现在了解一切别的东西那里是关于西部污点!

-范例Prepartation

-溶解缓冲

-抗体

-溶解电池

-胶凝体准备

-运行的胶凝体

-胶凝体调用

-控制

-西部污点

-读出

-分析和解释

您是否有非依附电池(例如T细胞线路或外围血细胞)或依附电池(例如成纤维细胞电池或COS电池)，您需要从媒体取消额外的蛋白质。 对于非依附电池您能轻轻地射击他们与离心法然后洗涤与PBS的药丸。 为依附电池、简单的与PBS的洗涤烧瓶或盘在西部污点之前。

西部污点分析检查蛋白质，和，因此我们希望蛋白质是从电池的版本并且防止蛋白质切开由蛋白酶。 我们需要这些对西部污点：

-保持事情冷! 在冰的4C在西部弄脏的电池病势渐退期间

-使用洗涤剂破坏电池的膜发行蛋白质

-缓冲

-抗化剂(蛋白酶分解抑制剂和磷酸酶抗化剂，如果我们将执行磷蛋白质的西部污点)

洗涤剂-溶解西部污点的电池

SDS和RIPA是使用西部弄脏，被用于溶解最新分析的蛋白质的洗涤剂。 需要这许多蛋白质是在电池或被找出的里面细胞膜里面，因此我们需要发行这些蛋白质能对他们的immunoblot。

您应该选择抗体为西部污点使用。 通常使用鼠标单克抗体或兔子多无性繁殖系的抗体。

您能使用或者抗体，不用任何被添加的组，或者使用被共轭对生物素的抗体。 这些抗体不要求

多无性繁殖系与西部污点的单克抗体

单克抗体为西部弄脏通常是好由于：

-更好的针对噪音的信号比例(在西部污点的更低的背景)

-他们的更高的特异性(您获得较少沾染的蛋白质或Ig)

-在西部弄脏的影片(较不检测的未指明的范围的整体擦净剂结果)

多无性繁殖系的抗体更好地适合免疫沉淀反应：

-他们认可更多表位

-有更高的欲望

在您之前的技巧为西部弄脏溶解：

如果您去蛋白质质量的(ie西部污点不是磷酸化的)的蛋白质：

-您在更大的数量能溶解(保留其它为其他蛋白质弄脏)

如果您去西部污点磷蛋白质(或磷酸化的蛋白质)执行以下是重要的：

-确定您使用磷酸酶抗化剂(例如钒酸盐，因为磷酸酶从您的蛋白质将取消磷酸盐! )

-也溶解在可能最小的数量的电池(ie在100 ul装载缓冲，这溶解执行，因为您能装载您溶解的大多电池。 这是重要的，虽然信号是相当弱的，当西部弄脏磷蛋白质的。)

如果您查看蛋白质蛋白质交往：

-不要使用SDS，它离解蛋白质蛋白质交往，并且蛋白质因而被弈质(特别是在煮沸以后)

-为西部弄脏的蛋白质蛋白质交往， ie当地交往您必须使用一种严密洗涤剂这样RIPA。

溶解：

-直接地在牌照或盘能执行

-射击电池

-保持在冰和寒冷-使用一个冰桶

-多少病势渐退缓冲的概测法能使用是： 10^5电池/病势渐退缓冲uL

-收集在eppendorf管并且标记(保留这些在冰)

在西部污点分析之前评定总蛋白含量：

如果您想要比较在西部污点分析的处理条件-这允许定量分析

-商业工具箱是可用的例如布雷得佛检验为评定总蛋白含量(从生物Rad)

- 0.1% SDS或更加极大可能干涉蛋白质评定

弈质蛋白质范例：

-添加蛋白质装载范例缓冲到整除数电池lysate -包含染料(也看到在胶凝体， 2% SDS)的迁移

-添加二硫化物脱氧剂例如beta -巯基乙醇

-在热水锅或热化块的煮沸(低温例如中间的90个程度减少蛋白质汇总)。

-戳在每支管盖帽的一个漏洞防止弹出

SDS-PAGE胶凝体是范围用于在电流面前分隔蛋白质的胶凝体矩阵。 低百分比胶凝体分隔更大的蛋白质，而更高的百分比胶凝体更好分隔更小的蛋白质。 问题是所有蛋白质有充电关联与他们，并且在电流这可能引起问题。 这由SDS的添加对蛋白质范例的解决。 SDS束缚对蛋白质每少量氨基酸并且中立化蛋白质有的充电区别。 这允许蛋白质分隔由范围和不由充电。

-根据多少蛋白质您将想要为西部弄脏装载，您应该使用小的梳子或更大的梳子。

-丙烯酰胺的百分比是重要的。 使用通常10%丙烯酰胺。

-一个解决的胶凝体使用在与酸碱度的底层8.8

-一个堆积的胶凝体(4-5%)酸碱度6.8被用于在装载以后包装蛋白质一起

-催化剂增加胶凝体的聚化加速聚化回应的APS和TEMED (形成和固体化)聚丙烯酰胺凝胶。

-仔细装载每个范例和迟缓地防止泄漏在运输路线外面的范例。

-装载每个运输路线并且使用范例缓冲在其中每一(防止区别)。

1. 分离10秒数的范例在煮沸以后。
2. 装载范例到每个运输路线
3. 装载兆瓦参考
4. 运行胶凝体在100V (恒定的电压)甚至改善在40 mA (恒定的当前)。 何时的注意蛋白质标记或梯子或者洗染前面能终止胶凝体。 如果您有时间，恒定的当前产生更好和更加急剧的结果。

-注意泡影在玻璃之间和在胶凝体之下-这意味着它运作

-，如果不是您切换了线索，并且能丢失所有您的范例， -注意蛋白质迁移(应该断开)!

-通过堆积的胶凝体(~ 50伏特)，这迟缓地最初运行产生更加锋利的范围。

-隔夜不要运行

-不要过度加热胶凝体(这造成胶凝体丢失坚硬，导致resoloving的贫寒和模糊的非常被形成的范围)

选择膜类型：

能使用：

-西部污点的PVDF膜

-西部污点的硝化纤维素膜

-尼龙膜(很少使用的现在可能撕毁)

调用的技巧到西部膜：

-一直穿戴手套! 使用镊子

-使涉及或镊子减到最小到膜

生物RAD转帐单：

(-)
在黑色的海绵
滤纸
胶凝体硝化纤维素
滤纸
海绵
(+)

调用：

-保留冷静在4C

-隔夜调用在35 V

-能在1时数迅速调用在更高的V

阻拦膜允许您最大化信号：噪声比例

-穿戴手套

-与5%的块烂醉(脱脂牛奶-粉末)或1 - 5% BSA (迟钝的乳清蛋白)磷酸化的蛋白质的。

-缓冲是TBST

洗涤在阻拦以后

-洗涤在阻拦步骤以后在主要抗体孵出期间不是重要的，因为人经常块。

-洗涤物通常完成与TBST缓冲。 能迅速执行与大容量TBST。

与主要抗体的孵出

-鼠标、兔子或者其他种类

-通常1 ： 1000年与TBST的稀释

-，如果强背景或许多未指明的范围是问题，孵出可以完成与5% BSA或牛奶。

洗涤在主要抗体以后

-不那么重要

-能迅速洗涤与TBST的大数量

附属抗体的孵出

-通常被稀释的1 ： 10， 000与TBST

-反鼠标、反兔子，或者其他抗体共轭与检测的HRP酵素

洗涤在附属抗体以后

-重要

-洗涤5 X与TBST的5分钟。

-，如果您必须确实冲，洗涤与TBST的更大的数量的至少3次。

检验结果的

-通常使用ECL (改进的化合光)

-影片显示并且被开发。 风险10秒是足够通常为总蛋白含量。 磷蛋白质可能要求2个- 20个周详风险。

-影片通常是XOMAT或相似的‘快速’影片

WB -西部污点

IB - immunoblot (西部弄脏的另一个术语)

SDS -钠十二烷基的硫酸盐(用于许多西部弄脏的解决方法的洗涤剂)

页- Polyacrilamide胶凝体电泳法

Ab -抗体(抗体被用于检测您的蛋白质利益)

HRP -辣根过氧化物酶

Luminol - HRP劈开导致轻的形成的基体

ECL -改进的化合光(提高轻的形成HRP + Luminol)的西部污点解决方法

kD/kDa - kilodalton (在30 - 80 kDa之间的多数蛋白质平均数)

RAM -兔子反鼠标Ig

Ig -免疫球蛋白(抗体同形象)

NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - phenylmethylsulfonyl氟化物

BSA -迟钝的乳清蛋白

NFDM -脱脂牛奶