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分子岗位指南对于西部弄脏的问题和解决方法: 公用西部污点问题和解决方法为他们!
请 与我们联系 以您的想法如果您能补充说来这个指南。
膜发光在暗室
解决困难的西部污点问题:
- 贫寒调用由于气泡在调用期间到膜
- 肮脏的影片当添加来开发员
- 开发员卷是肮脏的
对地点的解决办法在影片:
- 使用一根pasteur 吸移管作为路辗卷膜和形成胶冻在调用之前取消泡影保留膜和材料湿。
- 保持影片干净在添加来开发员之前
解决困难的西部污点问题:
- 通常由于许多未指明的范围
- 粗劣的主要抗体质量或老抗体
- 不足够阻拦
- 抗原蛋白水解的卵裂- 所有额外范围是更低的兆瓦比您的蛋白质, (ie 您的蛋白质被检测但被贬低了)
对许多个范围的解决办法在西部污点:
- 采购其它抗体或用一个新鲜的抗体股票替换
- 块用5% 无脂肪牛奶粉或BSA 在添加前主要。如果您已经阻拦, 考虑阻拦在主要和附属抗体孵出期间和并且增加阻拦牛奶或BSA 浓度。
- 保留一切在冰, 使用新鲜的范例, 存储- 80C, 和使用蛋白酶抗化剂譬如PMSF
解决困难的西部污点问题:
- 黑色或每部黑暗的影片; 影片太长期被暴露了
- 阻拦是不足的; 主要抗体未指明的捆绑和附属抗体没完全地被洗涤了
- 洗涤物是不足的
- 影片发光在黑暗! - 太高附属或主要稀释
对黑暗的影片的解决办法:
- 曝光为较少时间, 减少曝光时间
- 增加阻拦无脂肪牛奶粉5% 孵出的期限或增加浓度。
- 您能并且设法阻拦与主机动物的整体清液与(或以前) 附属抗体
- 增加洗涤的时期并且数量对帮助去除任一个未指明的信号由于微弱的抗体捆绑。
- 使用一种更强的洗涤剂洗涤- 代替TBST (非离子活性剂20), 使用更强的洗涤剂譬如也许提供一次更加严密的洗涤和减少背景(的NP-40 或SDS 做这只如果您结合是强的! - 并且洗涤去除某一您的范围利益!)
- 非常高附属抗体(甚至主要) 浓度- 执行优化实验确定适当的抗体稀释进一步稀释抗体。
解决困难的西部污点问题:
- 由于没有足够的蛋白质装载了在胶凝体
- 主要抗体是老或不好的
- 磷蛋白质通常需要隔夜主要抗体孵出
- 没有足够的附属抗体
- 在阻拦
- 显现出的试剂是坏/您犯了错误当准备他们
对低信号或微弱的信号的解决办法:
- 装载更多蛋白质范例胶凝体
- 尝试新鲜的主要抗体
- 孵化主要抗体overnite 为磷蛋白质在4 摄氏度(冷室振动器)
- 增加蛋白质的浓度(溶解范例在较少病势渐退缓冲)
- 减少阻拦的座席的浓度
- 检查显现出的试剂; 准备新ECL 和re ECL 膜
- 增加浓度或主要抗体潜伏期的长度
- 增加浓度或附属抗体潜伏期的长度
- 范围被抹上的由于热的胶凝体
- 范围模糊由于高压
对模糊的范围和不锋利的范围的解决办法:
- 减少电压或当前, 运行在冷室, 和准备新建连续缓冲(热导致胶凝体丢失其坚硬和其分辨能力)
- 前浸泡调用膜在适当的调用解决方法(由膜制造商确定) 为必需的时间。
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