西部污点

西部污点协议

西部弄脏的协议

西部弄脏协议

范例的准备为SDS-PAGE 胶凝体电泳法从准备的电池Lysates

胶凝体为SDS-PAGE 做准备
准备1X 连续缓冲
添加50 机器语言beta 巯基乙醇来950 机器语言范例缓冲(为1 机器语言) 。(只如果您未前添加beta 巯基乙醇到范例缓冲)
添加范例缓冲来各个范例(预先决定多少范例您能装载每井- BioRad 梳子可能稀薄保留关于30uL 。大梳子装accomate 于罐中由50uL 决定) 。
漩涡范例简要。
戳一个漏洞在各支管里盖帽(防止顶层流行当煮沸)
煮沸在热化block/water 浴在(95.C) 5 分钟(低温被显示防止未指明的蛋白质汇总)

在煮沸蛋白质范例以后- 装载和运行中SDS-PAGE 胶凝体

分离范例为1 分钟在高速。
装载范例入各个运输路线。
装载兆瓦(分子量梯子) 参考(您可以要
运行胶凝体在100V (100V 通过堆积胶凝体, 电压可能被增加由200V 决定当运行在分离胶凝体以大量连续缓冲)

蛋白质范例调用到膜

准备1X 调用缓冲
浸泡和震动胶凝体在调用缓冲15 分钟
浸泡硝化纤维素膜(或PVDF) 并且滤纸(额外厚实) 几分钟。
安置三明治在调用电池:

额外厚实的滤纸结算
膜
胶凝体
额外厚实的滤纸黑色

电调用: 35V overnite 或90V 1 个小时根据您的蛋白质或您的耐心的范围!

西部弄脏的协议或Immunoblotting

准备1X TBST 从储蓄解决方法。
准备阻拦缓冲(3% 迟钝的清液白蛋白或5% 弄脏级别牛奶(Blotto) 在TBST) 。(您可以想要尝试几个不同的阻拦的次和情况) 。
洗膜在1X TBST 以震动10 分钟。
块在室温1 个小时以阻拦缓冲(震动或圆板转器)
孵化您的膜(PVDF 或硝化纤维素) 与主要1. Ab 抗体隔夜(为困难弄脏适应蛋白质的ie phosphorylation) 或1 时数为(容易的条件譬如总蛋白含量) 在4.C (overnite) 或室温(1 时数孵出唯一) 用萨冉树脂换行(柔和震动) 报道。您能使用塑料木盆从美元存储为这(使用这些只为弄脏!) 或用途吸移管配件箱底层。稀释为主要抗体是大约1:1000 。参见制造商的指令。
洗涤以1X TBST 3 X 15 分钟
孵化您的膜(PVDF 或硝化纤维素) 与附属抗体, 2. Ab 30 – 45 分钟或(1 时数- 为困难的弄脏的情况) 在室温。稀释为附属抗体通常是1:10,000 或更高。(ie 1uL 附属在TBST 10mL 每膜) 参见制造商的指令。您可以想要添加您的抗体来阻拦解决方法减少未指明的捆绑特别是如果您得到了强背景在您的第一个实验。
洗涤与TBST 4-5 X 10 分钟。这是最重要的洗涤的步骤。
ECL (5min)
曝光对影片。通常西部污点的曝光时间是大约10-30 秒。长期(5-10 分钟) 为phosphorylation 。如果您有一个真正地微弱的信号, 或您需要装载更多蛋白质或设法增加曝光时间(30 分钟- 您能设法把它留在在casette 更加长式) 。
保留您的膜! 您能保留您的膜在TBST 1X 在冰箱有一阵子。您可能需要它为以下原因: 1) 检查装载(纸审核人也许请求总蛋白含量或装载标准譬如肌动蛋白) 。并且, 您能首字母探查为磷蛋白质和然后剥离和reprobe 为总蛋白含量。