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最扣人心弦的说明听见在科学, 那个宣布多数发现, 不是"尤里卡!" (我查找了它!) 但"是滑稽的..." ~Isaac Asimov
1 。试剂: 检验试剂由溶化做100 Coomassie 毫克蓝色G250 在50 机器语言95% 对氨基苯甲酸二。解决方法与100 机器语言85% 磷酸被混合和然后被弥补对1 升与蒸馏水。试剂应该被过滤通过Whatman 第1 滤纸和然后被存储在一个琥珀色的瓶在室温。它是稳定几个星期。但是, 在这时间期间染料也许沉淀从解决方法和因此被存储的试剂应该被过滤在用途之前。
2 。蛋白质标准。迟钝 γ- 球蛋白以1 mg/mL 的浓度(100 .g/mL 为microassay) 在蒸馏水里被使用作为储蓄解决方法。这应该被存储冻结在 –20oC 。因为坚实蛋白质湿气含量也许变化在存贮期间, 蛋白质的精确浓度在标准解法应该是坚定的从其absorbance 在280 毫微米。一个1 个mg/mL 解决方法的absorbance γ- 球蛋白, 在1 cm 轻的路径, 是1.35 。对应的值为二个替代蛋白质标准、迟钝的清液白蛋白和卵白蛋白, 是0.66 和0.75, 各自地。
3 。塑料和玻璃器皿被使用在检验应该任意是绝对干净和洗涤剂。石英(硅土) 分光光度表小试管不应该被使用, 因为染料束缚对这种物料。染料区域跟踪对玻璃器皿或塑料可能被漂洗去除以甲醇或洗涤剂解决方法。
1 。吸取在10 之间和100 蛋白质.g 在100 .L 总数量入试管。如果近似范例浓度是未知的, 检验稀释(1, 1:10, 1:100, 1:1000 的) 范围。准备各个范例重复项。
2 。为定标曲线, 吸取10 的复制数量, 20, 40, 60, 80, 和100 1 mg/mL .L γ- 球蛋白标准解法入试管, 和做每个100 .L 与蒸馏水。吸取100 蒸馏水.L 入一支进一步管提供试剂空白。
3 。添加5 机器语言蛋白质试剂来各支管和混合很好由反向或轻拍vortexmixing 。避免起泡沫, 将导致粗劣的增殖率。
4 。措施范例和标准的A595 反对试剂空白在2 分钟和1 h 之间在混合以后。100 .g 标准应该给A595 值的大约0.4 。标准曲线不线性, 并且精确absorbance 变化根据检验试剂的年龄。结果, 它重要修建一团定标曲线为各套检验。
Microassay 方法这份检验的表单对蛋白质是敏感的。结果, 它是有用的当相当数量未知的蛋白质被限制(参见也附注9) 。1. 吸取复制范例包含在1 之间和10 .g 在100 的一个总数量.L 入1.5 机器语言聚乙烯microfuge 管。如果近似范例浓度是未知的, 检验稀释(1, 1:10, 1:100, 1:1000 的) 范围。
2 。对定标曲线, 吸取10 的复制数量, 20, 40, 60, 80, 和100 100 .g/mL .L γ- 球蛋白标准解法入microfuge 管, 和对100 调整数量.L 用水。吸取100 蒸馏水.L 入一支管为试剂空白。
3 。添加1 机器语言蛋白质试剂来各支管和柔和地, 但周到地混合。
4 。评定各个范例absorbance 在2 和60 分钟之间在蛋白质试剂的添加以后。范例的A595 值包含10 .g γ- 球蛋白是0.45 。
参见: 布雷得佛蛋白质检验
修改从协议由Nicholas J. Kruger 。
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