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成功PCR 情况

参数为成功PCR

您有达到成功PCR 的问题吗?  许多系数可能影响您的PCR 您的通话结果譬如: 金属离子辅助因素、基体和基体类似物、缓冲和盐和Cosolvents 。  并且热量循环的对价:  PCR 船、温度和时间优化, PCR 放大作用循环、Enzyme/Target 和热起动。 

金属离子辅助因素和PCR

一个重要辅助因素为DNA 聚合酶在PCR 是镁氯化物。  其浓度必须被优选为每个primer:template 系统。回应的许多要素束缚镁离子, 包括底漆、模板、PCR 产品和dNTPs 。主要1:1 虫胶黏合剂为镁离子是dNTPs 的高浓度在回应。由于它是必要为自由镁离子担当酵素辅助因素在PCR, 总镁离子浓度必须超出总dNTP 浓度。典型地, 开始优化进程, 1.5 毫米镁氯化物被添加来PCR 在0.8 毫米总dNTPs 面前。这留下大约0.7 毫米自由镁为DNA 聚合酶。总之, 镁离子应该变化在浓度系列从1.5–4.0 毫米在0.5 毫米步骤。

基体和基体类似物为PCR

DNA 聚合酶非常高效率地合并dNTPs 。  他们能还合并被修改的基体, 当他们被使用作为补充要素在PCR 。基体实例被使用为DNA 聚合酶是: Digoxigenin-dUTP 、生物素11 dUTP 、dUTP 、c7deaza-dGTP, 和fluorescently 被标记的dNTPs 。为常规PCR, dNTPs 遗骸的浓度的被平衡在等摩尔比率, 即, 各 μdNTP. 并且注意那的200 M, 偏差从这些标准推荐标准也许是有利的在某些amplications 。例如, 当一个特定目标的任意mutagenesis 渴望, 失衡的dNTP 浓度促进高度misincorporations 由DNA 聚合酶。

缓冲和盐为PCR

根据DNA 聚合酶使用了优选的PCR 缓冲浓度, 盐含量, 并且酸碱度应该相应地被采摘对DNA 聚合酶。PCR 缓冲为Taq DNA 聚合酶包括50 毫米KCl 和10 毫米Tris-HCl, 酸碱度8.3, 在室温。这缓冲提供离子强度和缓冲能力需要在回应期间。它重要注意到, 盐含量影响primer:template 套楼公寓的Tm, 并且因此焖火温度。

Cosolvents

另外PCR Cosolvents 使用增加PCR 放大作用产量、效力, 和特异性。这些cosolvents 可能是有利在一些放大作用, 和不利的在其它放大作用。它不可能预言哪附加将是有用的为各所primer:template 套楼公寓和因此cosolvent 必须经验主义地被测试为各个组合。

热量循环的对价

PCR 船

PCR 必须执行在是与低数量酵素和核酸兼容并且有好热量调用特性的船里。通常, 聚丙烯被使用为PCR 船并且常规, 厚壁microcentrifuge 管被选择为许多热量cycler 系统。PCR 执行在一10 100 升–回应 μ缩放比例和经常要求evaporation/condensation 进程的预防在闭合的回应管在热量循环期间。一块矿物油重叠或蜡层为这个目的服务。最近, 0.2 机器语言薄壁船被优选了为PCR 进程并且使用激昂的盖子在管被拿着在范例块之内的oil-free 热量cyclers 被设计了。

温度和循环时间优化

它是必要的反应混合物到达变性、焖火, 和扩展名温度在各个热量循环。如果不足的占用时间被指定在任一个温度, 范例的温度不会被平均与那范例块。一些热量cycler 设计暂挂间隔根据块温度的时间, 但是其他人根据占用时间被预言的范例温度。如果一支常规厚壁管被使用在cycler 由块温度控制, 60-s 占用时间是充足的为平衡。额外时刻也许被推荐在(72.C) 扩展名步骤为更加长式的PCR 产品。使用一支薄壁0.2 机器语言管在cycler 由被预言的范例温度控制, 只15 s 必需。使用现有的协议或对发展协议至于使用在多个实验室, 它非常重要选择占用时间根据cycler 设计和管壁厚度。

PCR 放大作用周期编号

PCR 放大作用循环的数量应该被优选谈到目标DNA 的开始的浓度。它建议, 从40– 45 个循环放大50 个目标分子, 和25–30 个循环放大3 × 105 个分子对同样浓度。这非比率性由所谓的高原作用造成, 在产品累计的指数费率的减少发生在PCR 的延迟阶段。这也许由反应剂造成(dNTPs, 酵素的) 退化; 反应剂取尽(底漆, dNTPs); 最后产物禁止(焦磷酸形成); 竞争为反应剂由未指明的产品; 或竞争为底漆束缚由reannealing 被集中的(10 毫微米) 产品。它通常是适当运行循环的最小数字必要看渴望的特定产品, 因为不需要的未指明的产品将干涉如果循环的数量过份。

 酵素/目标

在一个标准整除数Taq DNA 聚合酶被使用为一100μ升回应, 有大约1010 个分子。各个PCR 范例应该被评估为它包含或也许包含目标复制的数量。例如, 1 ng lambda DNA 包含1.8 × 107 复制。为低输入复制编号PCR, 酵素成为限制并且它也许是必要递增给扩展名进程更多时间。热量cyclers 可能可靠地执行这个自动细分市场扩展名程序为了最大化PCR 产量。

热起动情况

所有上述优化并且适用于被设计, 从一开始, 以一个热起动方法的PCR 。经常, 热起动可能成功被合并早先优化PCR 没有更改回应条件。但是, 它通常支付reoptimize 在添加热起动以后。优化经常是一个平衡在生产同样多产品尽可能和overproducing 未指明, 背景放大作用之间。由于热起动很大地减少背景放大作用, 上部克制被上升在条件譬如酵素含量、周期编号, 和金属离子辅助因素浓度。高被定调了没有热起动的敏感PCRs 也许失败当热起动被添加。这可能由轻微的延迟造成在早期循环由混合或酵素起动造成。PCR 可能通常被恢复, 经常以在特定产品的坚固增量, 被简单增加限制参数或试剂。另外, 有优化特定对各个热起动方法。混合或酵素起动可能由PCR 数量、缓冲构成和酸碱度, cosolvents, 循环的情况影响, 等等。特定产品’s 文件, 经常产品插入, 应该被咨询对于信息关于这些对价。