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再组合蛋白质表达式

版权 © 分子岗位2006 年

当您想要描绘基因或蛋白质利益, 您必须首先学习其功能。在这个分子时代, 获得您的基因DNA 利益不是困难的。

表达DNA 作为蛋白质, ie. 再组合蛋白质, 你可能容易地然后进行功能研究使用再组合被净化的蛋白质。

一旦您有被净化的蛋白质您能举办:

• 蛋白质蛋白质交往实验
• 酵素动能学
• 蛋白质的功能研究
• 结构研究- 包括蛋白质结晶, 蛋白质结构和核磁共振。
• 您能并且使用蛋白质做抗体为进一步实验。

有二个主系统为再组合蛋白质表达式。一旦您得到您的DNA 被克隆, 您必须决定何处您想要放大您的蛋白质。这将是或一个prokaryotic (细菌) 或eukaryotic (通常酵母或哺乳细胞) 系统。您的系统选择将决定哪传染媒介您将需要克隆您的DNA 入尽管有起作用在E.Coli 的不同的促进者并且其他人服务最好以酵母或哺乳动物的系统。

如此蛋白质的表达式系统将您使用?

 系统为蛋白质表达式

Prokaryotic 蛋白质表达式系统

Prokaryotic 再组合蛋白质表达式系统有几好处。这些包括文化舒适, 和非常您不会必须长期等待得到蛋白质从细菌系统的迅速电池增长含义一旦您克隆您的DNA 。表达式可能容易地导致在细菌蛋白质表达式系统使用IPTG 。并且, 洗净是相当简单在prokaryotic 表达式系统并且有多血症商业工具箱可利用为再组合蛋白质表达式。

另一方面, 如果您需要使用您的蛋白质为功能或酶研究prokaryotic 系统是问题当多数蛋白质变得不能溶解在包括机体并且非常难收回作为功能蛋白质。此外, 多数如果没有所有过帐平移修改由细菌和因此您的蛋白质利益不添加不能是工作。酶研究也许因而无效。

Eukaryotic 表达式系统

Eukaryotic 基因真正地在家不是 “” 在prokaryotic 电池里, 既使当他们被表达在prokaryotic 传染媒介的控制之下。  一个原因是, E. 杆菌电池认可被克隆的eukaryotic 基因蛋白质产品作为局外人和频繁地毁坏他们。  另是, prokaryotes 不执行作为真核的这同样posttranslational 修改。  例如, 普通会被耦合对糖在一个eukaryotic 电池的蛋白质将被表达作为光秃的蛋白质何时克隆用细菌。  这可能影响蛋白质’s 活动或稳定, 或至少其对抗体的回应。  一个更加严肃的问题是, 一个细菌电池的内部象有助于不是eukaryotic 蛋白质适当的可折叠作为一个eukaryotic 电池的内部。  频繁地, 结果不正当地被折叠, 被克隆的基因非活动产品。 

Eukaryotic 系统为蛋白质表达式有:

• 酵母
• 哺乳细胞
• baculovirus 电池(昆虫)

所有这些系统是巨大eukaryotic 系统为再组合蛋白质表达式。
eukaryotic 蛋白质表达式系统好处包括情况您能得到非常高水平表达式。蛋白质容易净化使用是包括的入传染媒介包括他的特殊货签, Myc 和其它货签。

您能甚而采购藏匿您的蛋白质入媒体的质粒。所以您能继续生长您的系统和收集媒体没有溶解您的电池。没有包括机体忧虑并且您的蛋白质有原封过帐平移修改。这些是重要的如果您学习蛋白质并且/或者蛋白质蛋白质交往的功能。

eukaryotic 蛋白质表达式系统不利包括情况eukaryotic 电池增长慢比prokaryotic 电池。

表达式传染媒介与坚强的促进者

表达式传染媒介的主函数将通常产生基因的产品, 更多产品更好。  所以, 表达式传染媒介普通被装备以非常坚强的促进者; 理论基础是更多mRNA 被生产, 更多蛋白质产品将被做。
一个这样坚强的促进者是trp (色氨酸operon) 促进者。  它形成为几表达式传染媒介的基本类型, 包括ptrpL1 。  它安排一个trp promoter/operator 区域, 被核糖体束缚位置跟随, 和可能被使用直接地作为表达式传染媒介由插入一个外部基因入ClaI 站点。替代, trp 控制区域可能由 “剪切” 它与ClaI 和HindIII 和插入使便携式它在基因前面用其它传染媒介被表达

可诱导表达式传染媒介

它通常是有利保留一个被克隆的基因represed 直到我们准备好表达它。  一个原因是, eukaryotic 蛋白质被生产在细菌可能大量地是含毒物。  既使这些蛋白质实际上不是含毒物, 他们能加强auch 了不起的级别, 他们干涉细菌增长。  无论如何, 如果被克隆的基因被允许保留经常打开, 细菌负担基因从未会成长为足够巨大浓度导致蛋白质产品的意味深长的数量。  解决方法将保持被克隆的基因由安置关闭它顺流可能让厌恶的一个可诱导促进者。
紫胶促进者是可诱导的某种程度上, 据推测残余直到由综合inducer isopropylthiogalactoside 刺激(IPTG) 。  但是, 抑制由紫胶镇压者造成未完成, 并且被克隆的基因的某一表达式将被观察在没有inducer 时。  单程在这个问题附近将用运载其自己的lacI 基因的质粒或phagemid 表达我们的基因, 如同pBS 。  超额镇压者生产了由这样传染媒介保留我们的被克隆的基因被关闭直到我们准备好导致它与IPTG 。
其它方法是使用一个紧紧受控制促进者作为 λ 噬菌的促进者PL 。表达式传染媒介以这个promoter/operator 系统被克隆入寄主细胞负担一个温度敏感 λ 镇压者基因(c1857) 。  只要我们保持温度这些电池相对地低(32.C), 镇压者起作用, 并且表达式不发生。  但是, 当我们提高温度对nonpermissive 级别(42ºC), 温度敏感镇压者可能不再起作用并且被克隆的基因导致。

生产融合蛋白质的表达式传染媒介

当多数表达式传染媒介运行, 他们生产融合蛋白质。  这也许起初似乎不利因为被插入的基因的自然产品不被制作。  但是, 额外氨基酸在融合蛋白质可能是伟大的帮助在净化蛋白质产品。

考虑oligo 组氨酸表达式传染媒介, 其中之一有商标pTrcHis 。  这些有一个短的顺序upstream.of 输入舒展六组氨酸的多个克隆站点。  因而, 蛋白质用这样传染媒介被表达将是融合蛋白质与六组氨酸在其氨基末端。  为什么我们会想附有六组氨酸我们的蛋白质?  Oligo 组氨酸地区象这样有高亲合力为金属象镍, 因此我们能净化有这样地区使用镍亲合力色谱法的蛋白质。  这个方法秀丽是其简单和速度。  在细菌做了融合蛋白质之后, 我们简单溶解他们, 添加srude 细菌解压缩来镍亲合力列, 洗涤所有未捆绑的蛋白质, 那么发行融合蛋白质与组氨酸或组氨酸模式叫的咪唑。  这个程序允许我们重要收获纯净的融合在只一个步骤。  这是可能的因为非常少数如果任何自然蛋白质有oligo 组氨酸地区, 因此我们的融合蛋白质重要是唯一一个束缚对列。

我们若想要我们protein-free oligo 组氨酸货签呢? 

这些传染媒介的设计员周道地提供了一个方式去除它。  在多个克隆站点之前, 有编制程序区域为舒展氨基酸由蛋白水解的酵素enterokinase 认可。  如此我们能使用enterokinase 劈开融合蛋白质入二份:  oligo 组氨酸货签和我们要的蛋白质。站点由enterokinase 认可是非常罕见的, 并且机会它存在在我们的蛋白质里是无意义的。  因而, 我们的蛋白质不应该被砍当我们去除其oligo 组氨酸货签。  如果我们要, 我们能运行enterokinase 被劈开的蛋白质通过镍列更加分离oligo-hisitidine 片段从蛋白质利益。

λ 噬菌并且起基本类型作用对于表达式传染媒介;  你特定被设计为这个目的是 λgt11 。  这噬菌包含紫胶控制区域被lacZ 基因跟随。  克隆站点位于在lacZ 基因之内, 因此基因的产品被插入入这传染媒介将是融合蛋白质与B 半乳糖甘酶领导。
表达式传染媒介 λgt11 成为了一个普遍的通信工具为做和筛选DNA 图书馆。  λgt11 允许我们筛选一个组克隆直接地为正确的蛋白质的表达式。  主要配料必需为这个程序是DNA 图书馆在 λgt11 和抗血清被指挥反对蛋白质利益。
我们镀我们的 λ 噬菌与各种各样的DNA 插入和弄脏蛋白质被各克隆发行技术支持譬如硝化纤维素。  一旦我们从各块匾调用了蛋白质到硝化纤维素, 我们探查与我们的抗血清。  其次, 我们寻找抗体一定对蛋白质从一块特殊匾, 使用被标记的蛋白质A 从Staphylococcus-aureus 。  这蛋白质紧紧束缚对抗体和标记对应的地点在硝化纤维素。  我们检测这个标签由自动射线照象术或由phosphorimaging, 然后去我们的主要板材和采摘对应的匾。  注意我们检测融合蛋白质, 不是蛋白质利益。  此外, 它不事关如果我们克隆了一整体DNA 。  我们的抗血清是将起反应以几我们的蛋白质的不同的部份抗体的混合物, 那么甚而一个部分基因将做, 只要其编制程序区域被克隆在取向和读取框架和B 半乳糖甘酶编制程序区域一样。

为快速再组合蛋白质表达式复核看见:

再组合蛋白质系统

版权 © 分子岗位2006 年