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限制酵素消化

限制酵素

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信息关于怎样成为关于限制酵素和消化DNA 的一位专家!

背景在限制酵素

限制酵素(或限制核酸内切酶) 是剪切double-stranded DNA 由做二个中断的酵素, 一个通过每个双螺旋的磷酸盐中坚。酵素做这没有损坏DNA 的基础。虽然酵素中断DNA, 化学键可能由其它酵素改革以DNA 连接酶著名。所以, DNA 的限制片段从不同的染色体或基因可能一起被绑扎, 提供他们的末端补全。

 

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限制酵素的有用性在分子生物学

情况DNA 能被操作并且不同的DNA 片断能一起现在被接合, 被开放的新建研究领域如今想象。许多方法在分子生物学今天依靠限制酵素。"限制" 从情况被派生这些酵素initally 被发现了在 看上去 制约特定噬菌体的E. 杆菌("病毒的" 传染细菌) 。它被相信限制酵素是主机防御结构由细菌演变和其它有机体抵抗病毒传染, 和帮助以病毒顺序的排除。

1978 年, 诺贝尔奖为医学被授予了到Werner Arber, 丹尼尔·Nathans 和哈密尔顿史密斯为在限制核酸内切酶的他们的发现上, 导致重组脱氧核糖核酸技术的发展。对限制酵素的第一实用用途在科学和医学是E. 杆菌细菌的 操作 表达再组合人的胰岛素为糖尿病患者。

处理和使用限制酵素

限制 酶活性部件由数量restrition 酵素定义必需剪切1 微克噬菌体lambda DNA 对完成在1 时数的时期。

检验由酵素的制造商开发是很可能完成使用高度被净化的DNA (即质粒或lambda 噬菌的DNA) 作为基体, 并且导致最佳的结果以他们的特殊准备的检验适应。经常实验室条件作为理想不是, 并且酵素或一个更加长式的潜伏期轻微的超额使用帮助保证完全消化。

有将运作与各种各样的酵素的许多' 普遍' 酵素缓冲, 但他们经常不符合任何一酵素的最高效率的要求。由于普遍缓冲象高效率不是, 我们不推荐他们的定期用途在实验室里(特别是为复杂genomic DNAs; 复杂genomic DNAs 文摘通常是以将禁止酵素的高DNA 含量; 还, 需要更多部件酵素ard 更久的孵出时间为完全消化) 的相对地粗暴DNA preps 也许包含抗化剂。这总是最佳使用制造商的被推荐的检验条件为restricition 消化。一些制造商克隆了有非常不同的需求从其它同样酵素的版本的酵素, 因此以前检查使用。酵素含量总被给在酵素管的边。限制酵素被使用在实验室里总被存储在-20 摄氏度(在丙三醇基础), 和应该被保留尽可能与-20 摄氏度接近延长酵素的寿命。当设置文摘, 带来回应管给酵素冷冻机在冰桶; 从冷冻机去除酵素管和保留管在冰当工作与酵素。退回立即管到冷冻机当完成。使用pipetmen 选定限制酵素唯一和总使用一个新pipetman 要诀当去除酵素从储蓄管。

要诀在限制酵素用量

• 限制酵素所有制造商的特定缓冲把酵素供给, 并且这些应该被存储在-20.C 冷冻机。限制酵素应该并且被存储在-20.C 。
• 从未组成限制文摘与限制酵素组成超过1/10 由最终数量。这归结于情况限制酵素蛋白质被存储在丙三醇里。以浓度在10% 之上, 丙三醇禁止消化而且不仅可能导致星活动- 导致DNA 的出轨, 未指明的剪切。
• 设置控制文摘当使用限制酵素。这帮助您知道如果酵素适当地运作并且您设置回应很好。使用生成知道的分段存储模式的质粒DNA 。
• 当准备双重酵素文摘, 确定缓冲的盐含量。首先举办限制消化使用酵素以更低的盐需求, 那么由调整使用第二酵素回应管的缓冲对第二优选的盐含量。
• DNA 准备也许有可能禁止限制酵素消化活动的杂质。一些DNA 隔离工具箱甚而使用高EDTA 缓冲洗脱DNA 。这是好为DNA 存贮, 但EDTA 的高浓度可能禁止限制消化。PCR 净化您的DNA 和洗脱与TE 或浇灌如果您的酶活性被禁止仅您的DNA 查找好。您能添加Mg2+ 来回应和也看如果那帮助还。
• 如果您无法获得您的DNA 的完全限制消化在添加额外酵素以后, 设置一本新建文摘和添加spermidine 来2 毫米的最终浓度。

限制DNA 的酵素消化

分析对预备限制酵素消化

通常DNA 消化被举办在25 - 50 ul (微升), 当您想要检查或分析您的DNA 。这些叫做分析限制酵素消化。

你可能消化0.25 到2 ug (微克) 为分析准备。这是因为在agarose minigel (30ml), 你可能近似地形象化05.ug (50 ng, nanograms) 每范围。范围的形象化取决于DNA 的长度和相当数量DNA 存在。总之, 更加长式DNA 当前在范围, 更加容易是将是看见。

许多微克和更大的容量的DNA 消化从50 - 500 ul (微升) 或更多是预备的, 意味您DNA 片段为随后洗净做准备和克隆。

DNA 协议的限制消化

食谱 为限制酵素消化:

分析

您也许添加Mg2+ 来消化回应(以MgCl 的形式) 如果您使用DNA 的一个大数量。您应该做这特别是如果缓冲您洗脱了您的DNA 在被包含的EDTA 里。这是因为如果"X" 是大的, ie > 20ul 数量, 您也许需要添加镁EDTA 困境来4 摩尔镁为每摩尔EDTA 。因而, DNA 在EDTA 的一个1 毫米(milimolar) 解决方法将束缚4mM 镁。一个好经验法则将添加1 1ul 10mM MgCl 来DNA 每20ul 。

预备

孵化在37.C 1 - 3 时数。

1 个部件是足够的酵素对digest1 ug DNA 至少在1 时数。消化3 时数您能消化金额上限DNA 。因为您添加酵素10-20 个部件, 您能甚而消化DNA 10ug 在1 时数! 酵素是昂贵的多余地不浪费他们!

附注关于酵素用量:

• 保持 酵素冷。
• 总保留限制酵素 在冰 !
• 使您有限制酵素在冰的时间减到最小。您能容易地做这由采购基本上是金属块您保留您的酵素) 的一个冷盒(

参考:

Sambrook 、J. 、Fritsch, E.F., 和T. Maniatis.(1989) 分子克隆, 实验室手册。再版。冷的春天港口实验室按。页5.3- 5.32 。

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