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Genomic DNA 隔离协议

选择Genomic DNA 洗净方法

genomic DNA 隔离的目标依靠什么DNA 的申请在隔离以后。纯净、来源、DNA 的数量和质量是需要被论及在genomic DNA 提取之前的所有问题。一个整体许多不同的方法, 技术和工具箱是可利用的现在对研究员隔绝genomic DNA 从电池。

• DNA 的数量需要
• DNA 的分子量和范围
• DNA 纯净被要求
• DNA 的顺流申请
• 可利用时率
• DNA 提取技术或方法舒适
• 费用或货币可利用

家种或实验室特定DNA 提取方法为开发了他们和的实验室正常经常相当很好使用这些协议。

注意然而这些方法缺乏标准化。并且DNA 产量和DNA 质量总不是可再生的从一个人员对下。

背景在Genomic DNA 隔离和洗净

通常, 所有方法介入电池中断和病势渐退。这被核糖核酸撤除有时跟随(由RNAses 、盐或其它方法) 。选择哪个方法使用将取决于许多选择系数包括:

DNA 与蛋白质被隔绝由几个方法包括蛋白质的消化由酵素蛋白酶K. Proteins 被salting-out, 有机提取, 或束缚DNA 随后去除对固体阶段技术支持(譬如anion-exchange 列或硅土技术) 。

DNA 由对氨基苯甲酸二降雨雪或异丙醇降雨雪收回最终。

总之, DNA 的分离从电池和蜂窝电话要素可能被划分成四个阶段:

1. 电池中断
2. 电池病势渐退
3. 蛋白质和污染物撤除
4. DNA 恢复

在一些genomic DNA 隔离协议, 阶段1 和2 被结合。

材料需要为Genomic DNA 提取方法

病势渐退缓冲为Genomic DNA 食谱:

50 毫米Tris-HCl, 酸碱度8.0
50mM EDTA
1% SDS
10mM NaCl

Genomic DNA 洗净方法从组织样品

1. 选择组织样品使用。确定范例准备和适当地被保留在冰。如果范例立即不会被使用为DNA 提取, 范例必须适当地然后被存储在或-20.C 冷冻机为较长期或4.C 为短期(少量时数) 用量。
2. 剪切组织成更小的片断。为肝脏或其它软的组织, 不要担心做美好的片断。
3. 添加组织来被预冷却的(干冰) 灰浆, 添加立即液氮N2 。
4. 开始研组织入美好的粉末。依照必要添加更多Liq. N2 。调用冷的粉末到30 机器语言管, 事假开盖因此N2 可能蒸发。
5. 添加9 机器语言每被温暖的(5.C) 病势渐退缓冲和柔和地重新悬挂粉末。
6. 添加蛋白酶K 10mg/ml 100 ul, (即, 100 ug 在解决方法) 。孵化55.C 1-18 时数。阶段性地柔和地混合。添加蛋白酶K 在第一2 时数以后, 最佳100 ul: 3 时数添加蛋白酶K 在1.5 时数。
7. 款待范例非常柔和地。加1 机器语言3M Na0Ac (酸碱度4.0), 10 机器语言温暖的(55.C) 酚, 柔和地但throughly 混合5-10 分钟。
8. 分离范例15 分钟。
9. 重复温暖的酚提取。
10. 解压缩与相等的数量(10ml) 酚: CIA (1 份phenol:1 零件CIA: CIA = 23 份chloroform:1 零件异戊基的酒精)
11. 解压缩以相等的数量(10ml) CIA 提取
12. 上部阶段应该是相对地清楚的, 如果它包含大白色影响, 或是非常乳状的, (i) 再孵化在68.C 15 min., 和re 酚解压缩, (ii) 起始时间, 但长期孵化与P-K 。
13. 调用上部阶段对新建管。添加冷的对氨基苯甲酸二的2 个数量和柔和地混合(盐: Na0Ac 已经是在解决方法) 。使用异常分支和被密封的pasteur 吸取短管轴在DNA 之外。抹超额对氨基苯甲酸二在管的边。重新悬挂在TE 2-5 mls 。确定DNA 完全地被溶化(事假在柔和的振动器。)
14. 添加核糖核酸酶混合(100 ug 核糖核酸酶RNaseT1 A, 10U) 。孵化30 极小的37.C 。** 您能添加核糖核酸酶在蛋白酶K 之前, 孵化在37.C 1 个小时和然后开始蛋白酶消化。您能然后跳过步骤15 - 。
15. 添加100 ug 蛋白酶K, incubae 37.C 30 分钟。
16. 添加1/10 卷3M Na0Ac, 酚解压缩一次, Phenol:CIA 解压缩两次, CIA 解压缩一次。
17. 添加EtOH 的2.5 数量, 投入在-20.C 30 分钟。分离20 分钟。
18. 洗涤很好与70%, 去除所有EtOH 。如果您烘干, 不干燥。
19. 重新悬挂仔细地, 慢慢地in1-2mls TE (Tris Edta 缓冲) 。(1x 或0.1x) 。

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