检验的DNA- 蛋白质交往

得知怎样检验DNA 蛋白质交往。

检验的DNAProtein 交往

有检验DNA 蛋白质交往的四个重要技术。第一二个技术(补白捆绑和胶凝体流动性班次) 确定如果您的DNA 与蛋白质相处融洽。其它二个技术(DNase Footprinting 和DMS Footprinting) 表明何处交往目标站点在蛋白质和DNA 之间说谎在DNA 。

补白捆绑

硝化纤维素膜补白是常用过滤消毒解决方法。硝化纤维素补白可能束缚DNA, 但只在某些情况下。Singlestranded DNA 欣然束缚对硝化纤维素, 但双搁浅的DNA 单独不。另一方面蛋白质束缚, 并且如果蛋白质一定对double-stranded DNA 蛋白质Dna 复杂将束缚。参见硝化纤维素补白约束检验条款对于更多信息。

形成胶冻流动性班次

为了评定DNA 蛋白质交往这个技术依靠事实一小DNA 比同样DNA 有更高的流动性在胶凝体电泳法当它将跳起对蛋白质。我们能因此标记排序双搁浅的DNA 片段, 那么与蛋白质混合它, 和electrophorese 复杂。然后我们服从胶凝体在自动射线照象术检测被标记的种类。DNA 的小范围是重要在这个检验。如果一个整体基因被使用了其流动性已经会是非常低, 并且流动性班次由蛋白质捆绑造成难检测。所以我们必须近似地知道何处蛋白质束缚对DNA 因此我们能准备一个短的限制片段, 甚至将包含目标站点为蛋白质的综合double-stranded 低聚核苷酸, 但少许。

DNase Footprinting

一旦我们知道蛋白质束缚对一指定的DNA 我们能使用footprinting 发现何处目标站点说谎在DNA 。Dnase footprinting 依靠情况蛋白质, 由束缚对DNA, 盖束缚位置并且因此保护它免受攻击由Dnase 。这样它留下"脚印" 在DNA 。第一步在一个footprinting 的实验是结束标记DNA 。我们能标记或者子线, 但只一个每实验。其次, 我们束缚蛋白质对DNA 。然后我们对待DNA 蛋白质复杂与Dnase I 在温和条件(很少Dnase 下), 以便平均数仅仅一个被削减发生每DNA 分子。其次, 我们从DNA 取消蛋白质, 分离DNA 子线, 并且electrophorese 收效的片段在高分辨率polyacylamide 形成胶冻沿着范围标记。片段将出现从DNA 的另一末端, 但我们不会检测他们因为他们是未贴标签的。我们总包括一个控制与DNA 单独(没有蛋白质), 和通常使用超过一蛋白质含量因此我们能看由范围的逐渐失踪在脚印区域DNA 的保护取决于被添加的蛋白质的浓度。脚印代表DNA 的区域由蛋白质保护, 和告诉因此我们何处蛋白质束缚。

DMS Footprinting

Dnase footprinting 给束缚位置的地点的一个好想法为蛋白质, 但Dnase 是大分子和是因此为探查束缚位置的美好的详细资料的一个相当直言的票据。哪些意味, 那那里也许是空白在交往在蛋白质之间并且Dnase 不会适合和因此的DNA 不会检测。而且, DNA 约束蛋白质频繁地心绪不宁DNA 在约束区域之内, 变形双螺旋。这些扰动是有趣, 但由Dnase 常规不检测footprinting 因为蛋白质保持Dnase 去。做更加详细footprinting, 我们需要可能适合入DNA 蛋白质角落和裂口复杂的一个更小的分子并且显露更多交往的微妙。为这个工作的一个喜爱的工具是甲基化的座席dimethylsulfate (DMS) 。

用DMS footprinting 我们开始以与在Dnase 里footprinting 相似的方式, 由结束标记DNA 和捆绑蛋白质。然后我们甲基化DNA 蛋白质复杂与DMS, 使用一张温和的处理以便平均只一甲基化甚而发生每DNA 分子。其次, 我们撞出蛋白质, 和对待DNA 与取消甲基化的嘌呤的试剂, 创建apurinic 站点(deoxyriboses 没有基础) 在DNA 。然后我们中断DNA 在这些apurinic 站点。这些回应是相同象Maxam-Gilbert DNA 程序化回应。最后我们electrophorese DNA 片段和autoradiograph 胶凝体检测被标记的DNA 结合。各个范围结束在由蛋白质甲基化和因而无保护的核苷酸旁边。

看见 DNA 分子在3 维数

脱氧核糖核酸