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DNA Footprinting

版权2007 分子岗位

背景在DNA Footprinting

DNase footprinting 是启用DNA 蛋白质交往检测由利用属性的一个分子生物学方法蛋白质与DNA 相处融洽将保护DNA 在那个交往站点免受限制消化或DNAase 酶卵裂。包含特定束缚位置的DNA 限制片段被标记在一个末端, 通常与32P 和被使用为footprinting 。

蛋白质和DNA 被允许一起杂交和束缚。

DNA footprinting 运用酵素DNase I 或 deoxyribonucleic 酸nuclease I 为了消化或任意剪切radiolabeled (或标记) DNA 留下蛋白质一定的DNA 被保护。DNA 限制片段轻微被对待与DNase I, 做唯一子线中断(裂口) 在DNA 。小量的酵素被使用这样, 有平均数少于1 nick/strand 。回应然后被终止, DNA 被弈质, 并且混合物运行在弈质的聚丙烯酰胺程序化胶凝体。这些片段由胶凝体电泳法分离由分析暴露检测被保护的DNA 地区条带卵裂模式在胶凝体。

DNA 的卵裂模式在没有DNA 约束蛋白质时, 典型地指自由DNA, 与DNA 比较的卵裂模式在DNA 约束蛋白质面前。如果蛋白质束缚DNA, 束缚位置被保护免受酶卵裂。这保护导致一个清楚的面积在指"脚印" 的胶凝体。

由变化DNA 束缚的蛋白质的浓度, 蛋白质的约束亲合力可能估计根据脚印被观察蛋白质的极小的浓度。

DNAse Footprinting 缓冲食谱

DNase Footprinting 约束缓冲食谱

2X 没有KCl/为10mls:

金额: [ 最终]
Tris-HCl pH7.6: 1M 500 ul: 50 毫米
氯化镁: 1M 125.ul: 12.5mM
EDTA: 2 ul 0.5M: 1mM
丙三醇: 2 mls: 20%
DTT: 1M 10 ul: 1 毫米

约束缓冲(胶凝体班次缓冲)

5X 没有KCL
[ 最终]: 配料
20%: gylerol
5mM: 氯化镁
2.5mM: EDTA
2.5mM: DTT
250mM: NaCl
50mM: Tris-HCL, 酸碱度7.5
0.25mg/ml: 多(二dc) 多(二dc)

Ca/Mg 缓冲

为10mls
氯化钙: 1M 50 ul: 5 毫米
氯化镁: 1M 100 ul: 10 毫米

装载解决方法
0.1 M: NaOH:formamid (1:2 v/v)
0.1%: 二甲苯cyanol
0.1%: bromophenol 蓝色

终止缓冲
10mls
NaCl: 400 ul 5M: 200 毫米
EDTA: 600 ul 0.5M: 30 毫米
SDS: 1 机器语言10%: 1%

TEBe (Tris EDTA Beta mercap 。)
Tris-HCl, 酸碱度7.6: 1 M 500 ul: 50 毫米
EDTA: 0.5 M 2.ul: 1 毫米
Beta 巯基乙醇: 10 ul: 15mM

10 x K 缓冲
为1 机器语言
Tris-HCl 酸碱度7.5: 1 M 100 ul: 100 毫米
氯化镁: 1 M 100 ul: 100mM
DTT: 1M 50 ul: 50 毫米
dH2.O: 750 ul

DNAse Footprinting 协议

DNA 被使用通常包含您的蛋白质束缚位置利益。DNA 被净化, 那么被消化以限制片段是appopriate 范围。DNA 片段被标记在一个末端(束缚位置> 25 bp 从末端) 。

一子线标记可能是accomplised:

1. 隔绝片段以限制enzyme(s) 包含5' 突出物, 标记与Klenow 和适当的热的核苷酸。然后文摘与去除一个末端的酵素。
2. 隔绝片段被消化与创建5' 和3' 末端的限制酵素, 标记与Klenow 只将标记5' 突出物。
3. 和在"a" 但与任何酵素和使用polynucleotide 激酶标记3' 末端(激酶) 并且消化末端的当中一个与第二(第三) 限制酵素。
   (提示: 如果标记与Klenow, 在回应的结尾添加同样核苷酸的冷的核苷酸超额被标记(即如果您使用dCTP32, 添加dCTP 在末端) 确定所有末端相等地被装载。

为Klenow 片段, 0.3.ug 带来100 ul 在TE, 热杀害Klenow 在68 .C 10 分钟。

标记以一5' 突出物

范例RXN: 15 ng 是对各种回应的需要。如果做探针为许多回应正义增量数量DNA 由300 ngs 决定。
15ng: DNA 片段
2 ul: 10x K 缓冲
5 ul: 32P dCTP 3.33 uM 10 uCi/ul
2 ul: 2mM @ dA, dG dTTP
1 ul: Klenow
20 ul 最终数量, 37.C 30 分钟。
-- 添加1 ul 10mM dNTP, 5 分钟@ 37.C 。

-- 添加80 ul TE 。68.C 15 分钟, 投入了冰。
-- G-50 旋转列(旋转在大约2000g)
-- 添加1/10 卷3M Na0Ac, 2.5 数量EtOH, 冰30 分钟, (选项如果[ DNA ] 是= 或> 3 ng/ul 您也许直接地张贴G-50) Microfuge 30 分钟。
-- 洗涤与70%
-- 干燥带来5.ul

约束回应为DNase Footprinting

约束回应应该有在10 和150mM KCl 之间(更多盐减少束缚但增量特异性) 。典型的浓度是50mM 。

蛋白质DNA 捆绑:
2X 约束缓冲25 ul 没有KCl
3 ng/ul 5.ul unilabeled DNA
x KCl ul 等于10-150 毫米KCl
dH20 对等于50 ul 减数量为捆绑protien
1-3 DNA 约束蛋白质Footprinting 部件(或10 到160 ug 粗暴核解压缩)

-- 混合柔和, 冰10 分钟。

保留规定期限在头脑里,
-- 添加RT Ca/Mg 解决方法50 ul, 18.C 为1 分钟。
-- 添加稀释RQ1 DNase 的3 ul (0.05 u/ul 被稀释在Tris) 孵化1 分钟。
-- 终止添加90 用37.C 终止解决方法,

-- 您如果酚: CIA, 和CIA 解压缩, 和对氨基苯甲酸二沉淀物。
-- 重新悬挂在装载解决方法4.ul 。
-- 运行在5% 标准尿素Dna 程序化胶凝体(考虑楔子胶凝体) 与appopriate 装载运输路线譬如DNA 梯子、未割减的DNA, 和控制。

分析footprinting 的模式。

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