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得知DNA 克隆。
DNA (短为complemantary DNA 或复制DNA) 是核糖核酸, 通常mRNA 的DNA 复制。有时我们想要做DNA 图书馆, 一套克隆reprensenting 越多越好mRNAs 在一个指定的电池类型到时。这样图书馆可能包含成千上万不同的克隆。其它次, 我们想要做一特殊DNA- aclone 包含一mRNA 的DNA 复制。我们使用的这个技术依靠一部分在我们希望达到的哪些目标。
如果我们想要修建DNA 图书馆, 我们能使用依靠处理叫的裂口转换的一个简单但有效方法。裂口转换精华是DNA 同时撤除在DNA 之前裂口(一个唯一搁浅的DNA 中断) 并且综合在裂口之后。实际结果将行动, 或转换裂口在5'-3 ' 方向。我们通常使用裂口转换的酵素是E.coli DNA 聚合酶I, 有5'-3 ' exonuclease 活动允许酵素贬低DNA 在裂口之前当它行动。
中央部份任一个DNA 克隆程序是DNA 的综合从一块mRNA 模板使用反向transcriptase 。反向transcriptase 是象其他DNA 综合的酵素是, 它无法起动DNA 综合没有底漆。避过这个问题, 我们利用poly(A) 尾巴在多数eukaryotic mRNAs 的3' 结束和使用oligo(dT) 作为底漆。oligo(dT) 是补全对poly(A), 因此它束缚对poly(A) 在mRNA 的3' 结束和奘填DNA 综合, 使用mRNA 作为模板。
在mRNA 被复制了之后, 产生一唯一搁浅的DNA ("第一条子线"), 我们部分贬低mRNA 与核醣核酸H (核糖核酸酶H) 。这酵素贬低RNA/DNA 杂种的核糖核酸子线什么我们需要开始消化核糖核酸从我们的第一子线DNA 。残余的核糖核酸片段起底漆作用对于做"第二条子线," 使用一作为模板。这是进程的裂口转换阶段并且再, E. 杆菌DNA 聚合酶I 是我们过去常执行裂口转换回应的酵素。实际结果是一double-stranded DNA 以核糖核酸的一个小片段在第二条子线的5' 结束。
我们的下个任务是绑扎DNA 对传染媒介。这是容易以genomic DNA 我们的片断被劈开与限制酵素, 但DNAS 没有稠粘的末端。我们能一起绑扎直言的末端, 即使那是一个相对地无结果的进程。但是, 如果我们想要高效率的结扎术由稠粘的末端买得起, 我们能添加稠粘的末端(oligo[dC ]) DNA, 使用酵素称终端deoxynucleotidyl 转移酶(TdT) 或简单终端转移酶和deoxribonucleoside triphosphates 的当中一个。在案件, 我们使用dCTP 。酵素添加dCMPs, 一次一个, 来DNA 的3' 结束。相似, 我们附有oligo(dG) 末端我们的传染媒介和允许oligo (dC)s 锻炼对oligo(dG)s 。这带来传染媒介和DNA 在可能被使用直接地为转换的一再组合DNA 。基本配对在低聚核苷酸尾巴之间是足够强的, 结扎术不必需在转换之前。DNA 连接酶在被变换的电池里面进行最终结扎术。
看见 DNA 分子在3 维数
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