所有关于polyclonal 抗体。
Polyclonal 抗体相关外部资源- 协议:
并且访问 抗体 岗位为更多在Polyclonal 抗体。这是列出抗体供应商的一个新建站点, 得知抗体, 和协议。
Polyclonal 抗体协议:
Polyclonal 抗体
Polyclonal 抗体 是抗体从许多B 电池或B 电池线路被派生, 相似与抗体混合物被查找在血液清液。
Polyclonal 抗体是因此许多不同的抗体特异性混合物。
Polyclonal 抗体准备被采购是许多不同的特异性抗体混合物对同样抗原。
兔子、鼠标、山羊、鸡, 或其它动物的免役生产polyclonal 抗体。动物清液可能直接地被使用, 然而最好净化polyclonal 抗体为实验室用量。
Polyclonal 抗体准备
根据协议由大卫Bowtell 博士
鼠标的免役:
射入使鼠标免疫为polyclonal 抗体的生成应该使在间隔至少二个星期单独。
以下2 辅药成功:
- Freund 辅药和MPL+TDM 辅药(RIBI ImmunoChem Research, Inc.) 。MPL 比第一辅药较不危害的。
- 为第一免役射入: 注射15 - 50 ug 如果抗原在200 ul 辅药, 皮肤下地被注射。
- 第二射入应该以后发生2 个星期; 您必须然后提高以15 - 50 ug 抗原在辅药。(如果时间允许, 再提高一月份以后) 。
- 七个到10 个日以后流血鼠标和测试清液使用将被使用为审查的检验。如果滴定量不是足够高, 提高再二个星期在早先提高以后。
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清液准备:
- 在收集以后, 血液应该被允许凝结60 分钟。在37.C 或O.N 在4.C 。
- 分离凝块从管(敲响的) 边使用pasteur 吸移管。安置凝块在4.C O.N 。
- 转动在10000 x g 10 min. 在4.C 分离清液。
- 清液可能被存储在-20.C 在添加丙三醇以后来50% 。
如果monoclonal 抗体渴望, 一旦您安排一"好" polyclonal 和一个可靠的审查方法进行对下个步骤。
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兔子:
兔子重要免疫如上所述。射入:
- 首先在Freund 的完全100-200ug/1ml 射入, 二个站点(在各肩膀) 。
- 其次1 月份以后在Freund 的未完成如上所述。
- 渗漏2 个星期以后。提高2 个星期以后再(2 个+ 2 个星期循环) 。
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POLYCLONAL 抗体的生产在兔子(NEUSEELAND 白色)
根据协议由Dr.Walter 斯蒂芬。
兔子应该是3-4 公斤在重量和大约3 个月大。关于兔子三分之一有内在反角质素抗体和immunoactivity 为各种各样的蜂窝电话要素。这强调采取前免疫清液的重要性从任一只指定的兔子。
缓冲和解决方法:
- 饱和的氨盐基sulfate 解决方法, 2 毫米EDTA,
酸碱度8.0
- 50 毫米氨盐基醋酸盐, 酸碱度8.0
- 70% 对氨基苯甲酸二
- Freund 的辅药(完全& 未完成)
- 磷酸盐缓冲的盐(PBS) (参见下面)
- 凡士林
- 二甲苯
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- 带来兔子从其笼子和安全地安置它在一个克制的配件箱留下耳朵容易接近。相对地保留兔子安静。血液的数量50 机器语言可能从主要动脉容易地被收集运行在耳朵的背部表面下的中心。
- 刮左耳朵在左静脉附近与一个新鲜的剃须刀。
- 擦拭耳朵与70% 对氨基苯甲酸二或异丙醇。
- 擦拭耳朵与二甲苯在动脉静脉循环附近膨胀。
- 暂挂耳朵(固定) 并且收集管的要诀在一只手里和与自由手插入19G 皮下针入膨胀的动脉。血液应该开始流立即入收集管。为最佳的结果使用动脉的部份中途沿耳朵。
- 收集50 机器语言血液。向问题的针项施加压力先前对终止灵菌。
- 适用于凡士林耳朵安慰二甲苯激怒。
- 把额外凡士林放在剪切上。
获得清液:
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- 漩涡管以被收集的血液涂上表面和防止凝块附件对管。
- 孵化在37 oC 1 个小时。
- 分离在2,500 g (设置#7 在临床台式) 10 分钟。
- 去除凝块和转动清液在3,000 g 10 分钟。
- 清液应该被存储冻结。
氨盐基IgG 的Sulfate 降雨雪从清液 (4 oC, 被执行在冷室):
氨盐基sulfate 降雨雪是一个容易的方法获得一个相当纯净的IgG 分数。
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- 水池清液从一只兔子
- 重量清液
W1 = _____ g
- 洗涤管以分钟。PBS 和再称。
W2 = _____ g
- 添加W2 饱和的氨盐基sulfate, 2 毫米EDTA, 酸碱度8.0 的2/3 数量
注: 添加非常慢慢地, dropwise 当搅动在4 oC 或使用蠕动的泵浦。
- 搅动15 分钟。
- 调用到40 机器语言离心机管; 洗涤烧杯以3 份PBS: 2 份氨盐基sulfate 和添加来管。
- 旋转在12,000 g (Beckman JA-20: 10,000 转每分钟) 10 分钟。
- 放弃上层清液。
- 重新悬挂药丸在PBS [ 1/2 W1 = 1/2 卷。] 。
- 转动在12,000 g 10 分钟, 放弃药丸。
- 收集上层清液在烧杯, 洗涤墙壁里与PBS
。
确定W3 = _____
- 添加2/3 卷。W3 饱和的氨盐基sulfate, 当搅动。持续搅动15 分钟。
- 调用暂挂到40 机器语言离心机管, 洗涤管用PBS/ammonium sulfate 解决方法。
- 转动在12,000 g 10 分钟。
- 放弃上层清液。
- 重新悬挂药丸在1/4 W1 PBS 。
- 渗析反对PBS, 3 时间6 时数每。
- 投入清液在一支毕业的管, 冲洗透析袋子很好与PBS 。
- 带来1/2 W1 = 1/2 卷在PBS 。
- 确定蛋白质含量和整除数为存贮。评定吸收在280 毫微米。1 个mg/ml IgG 解决方法的吸收是大约1.5 。
免役:
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- 溶化~400-600 g 抗原(~200-300 g 每射入) 在2.2 机器语言50 毫米氨盐基醋酸盐, 酸碱度8.0 或其他适当的缓冲。浓度取决于蛋白质抗原性被注射。
- 数量抗原必要使动物免疫取决于它抗原性和免役方法。如果蛋白质以低抗原性被使用, 它将是有用弈质蛋白质以SDS (0.2% 的) 低浓度。唯一高度被净化的抗原应该被使用为polyclonal 抗体的生产。一个容易的方法获得纯净的抗原是由SDS-PAGE 。蛋白质可能调用到硝化纤维素板料, 被弄脏与Ponceau S, 被删去与剃须刀, 和被使用作为抗原(寻找标准协议在SDS-PAGE) 。
- 勾画1.1.ml Freund 的完全辅药与20G 皮下针,
那么勾画1.1 机器语言抗原解决方法。冻结剩余1.1 机器语言为提高。
- 保持柱塞固定, 去除针和附有一个不育的三通的止流栓。
- 与辅药混合抗原由附有第二个玻璃注射器止流栓和注射反复。(小心: 一些塑料注射器也许起反应与矿物油。)
- 完全乳化液将被形成在大约20-30 分钟以后; 由在解决方法的黏度的一个相当突然的增量表明。
小心: 请务必, 架置是安全!
- 在混合的等待以后大约20 分钟在射入之前对控制, 混合物是完全的(如果未完成, 油将分离) 。
- 刮兔子从肩胛骨到骨盆。
- 清洗与70% 对氨基苯甲酸二或异丙醇
- 注射在皮肤之下入大约10-20 边沿脊椎在肩胛骨和骨盆之间使用21G 皮下针。(附注: 第一射入一个星期在前preimmune 灵菌以后) 。
- 等待一月份和提高与抗原和未完成辅药混合物。避免伤痕从早先射入。
- 流血在一个星期以后检查免疫回应。提高应该被重复, 如果免疫反应是太微弱的; 但是, 一只另外兔子应该被选择, 如果兔子没有起反应根本/LI >
参考: Garvey 、J.S. 、Cremer 、N.E., & Sussdorf, D.H. (1977) 在: 方法在免疫学方面。客栈。Benjamin/Cummings Publishing Company 。读取质量。页545
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Polyclonal 抗体审查使用ELISA 检验
ELISA 协议为抗体屏幕:
材料为ELISA:
. 板材- 96 井Dynatech Immulon, 型2 。(Fisher 17-0221-199) 。
. PBS, TBS
. PBS + 0.1% 非离子活性剂20 或TBS + 0.1% 非离子活性剂20 。
. 阻拦解决方法= 2% BSA (型V) 在PBS 。(添加0.02% 迭氮为长期储备。)
. Elisa 缓冲= 2% BSA + 0.1% 非离子活性剂20 在PBS (迭氮选项) 。
. 酵素被链接的抗体= 辣根过氧化物酶1
. 基体= ABTS - 100X (从Zymed 00-2001)1
. HRP 缓冲: 100mM Na 枸橼酸盐酸碱度4.2(490 毫克柠檬酸+ 720 毫克Na 枸橼酸盐
二水合物+ 50 机器语言H2.O, 酸碱度4.2) 。
. 过氧化氢30% (1000X)
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ELISA 协议为Polyclonal 抗体
1) 抗原的ADSORBTION
a) 稀释Ag 对10 ug/ml 在PBS 。
b) 添加Ag 解决方法100 ul 来每个很好。
c) 留下O.N 用萨冉树脂换行被盖, 在4.C 。
2) 阻拦
a) 洗涤未捆绑的Ag 由倒置板材和甩井烘干。
b) 冲洗由再添加PBS 来每个井和倒置它(用途喷瓶) 。
c) 重复冲洗两次。
d) 添加阻拦解决方法100 ul 来每很好, 留下1 时数在室临时或O.N 在4.C 。
3) 主要抗体
a) 添加抗体被测试:
电池Sup = 25 ul, 混合很好由上上下下pipeting (10 次) 。
清液、腹水= 1:100 和serie 1/5 稀释。做稀释在阻拦解决方法。
b) 留下1 时数在室临时或O.N 在4.C 。
4) 附属抗体
a) 洗涤未捆绑的抗体4 次与PBS + 0.1% 非离子活性剂20 。
b) 添加酵素被链接的抗体100 ul 来所有井。做适当的稀释在Elisa 缓冲。(前: HRP 是2000X) 。
c) 留下1 时数在室临时或O.N 在4.C 。
5) 基体
a) Disolve 基体在水中。
b) 洗涤板材4 次与PBS + 0.1% 非离子活性剂20 (用途TBS 代替PBS 为AP) 。
c) 添加基体100 ul 来每口井。
d) 观望颜色发展。这能采取从几第二（个）对20 分钟。
e) 如果需要, 终止回应由添加4M NaOH 50 ul 。
f) 读吸收在Elisa 阅读程序在正确波长(为HRP 系统416 毫微米, 为AP - 405 毫微米) 。
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