Welcome to Molecular Station! Välkommen till Molekylär Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du måste registrera dig innan du kan posta i vårt forum eller använda vår avancerade funktioner. Register Now! Registrera dig nu! Its Free and Fast! Dess fria och Snabbt!

Already registered? Redan registrerad? Login now below. Logga in nu nedan.

User Name: Användarnamn:

Password: Lösenord:

Remember Me? Kom ihåg mig?

Already registered and Forgot your password? Redan registrerad och Har du glömt ditt lösenord? Click below to recover it. Klicka nedan för att återkräva det.

Recover Lost Password Återskapa förlorat lösenord

Join now - it's fast and free! Gå med nu - det är snabbt och gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station är den största nätverk av forskare, vetenskapsmän och vetenskap älskare var som helst!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

RNA Protocols RNA-protokoll

RNA Encyclopedia RNA Encyclopedia

RNA Bioinformatics RNA Bioinformatik

RNA Forum RNA Forum

RNA Blog RNA Blog

RNA News RNA Nyheter

RNA Isolation RNA: Isolering

RNA Extraction Background Information RNA Extraction Bakgrundsinformation

Obtaining high quality, intact RNA is the first and often the most critical step in performing many fundamental molecular biology experiments, including Northern analysis, nuclease protection assays, RT-PCR, RNA mapping, in vitro translation and cDNA library construction. Erhålla hög kvalitet, intakt RNA är den första och ofta den mest avgörande steg i utförandet av många grundläggande molekylärbiologiska experiment, inklusive norra analys, nuclease skydd analyser, RT-PCR, RNA-mapping, in vitro översättning och cDNA bibliotek konstruktion. To be successful, however, the RNA isolation procedure should include some important steps both before and after the actual RNA purification. För att lyckas dock RNA isolering förfarande bör omfatta några viktiga steg både före och efter själva RNA rening.

Basic RNA Isolation Methods Grundläggande RNA Isolering Methods

Depending on the RNA to be extracted, there are properties of RNA that allow it to be isolated away from other cellular materials such as proteins, DNA and even lipids. Beroende på RNA som skall utvinnas, finns det egenskaper hos RNA som gör att den isoleras från andra poröst material såsom proteiner, DNA och även lipider.

Messenger RNA or mRNA contains a stretch adenosine residues in the form of a poly(A) tail. Budbärar-RNA eller mRNA innehåller en sträcka adenosin restprodukter i form av en poly (A) svans. This has been exploited to allow mRNA to be bound to poly(T) affinity columns or beads. Detta har utnyttjats för att möjliggöra mRNA till att vara bunden till poly (T) affinitet kolumner eller kulor.

Tips for RNA Extraction and Isolation Tips för RNA-extraktion och isolering

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Om du har ett föredra för att isolera RNA, fortsätta att använda den.

If you haven't isolated RNA from your system before and your organism is not on the following list, we can help you identify established protocols that have been used for isolating RNA for Northern blotting or RT-PCR from your system. Om du inte har isolerat RNA från ditt system innan och din organism inte om följande lista kan vi hjälpa dig att identifiera etablerade protokoll som har använts för att isolera RNA för Northern blotting eller RT-PCR från ditt system. These types of protocols will also yield "microarray-grade" RNA. Dessa typer av protokollen kommer också att visa "microarray-grade" RNA.

Always run an agarose gel of your RNA to assess the quality. Alltid köra en agarosgel i din RNA att bedöma kvaliteten.

NOTE: If you use a non column based purification reagent such as TRIzol we recommend you precipitate your RNA a second time from ethanol or you pass it through an Rneasy column or similar device. OBS: Om du använder en icke kolumn bygger rening reagens såsom TRIzol rekommenderar vi att du fällningen din RNA en andra gång av etanol eller du klarar det via ett Rneasy kolumn eller liknande anordning. This insures removal of all organic contaminants (See spectra below). Detta försäkrar avlägsnande av alla organiska ämnen (Se spektra nedan).

RNase Inhibitors Used in RNA Extraction and Isolation RNase Hämmare Används i RNA-extraktion och isolering

Checking RNA Isolation Quality and Quantity Kontrollera RNA Isolering kvalitet och kvantitet

Efficient nuclear/cytoplasmic fractionation can be quickly assessed by denaturing agarose gel analysis (see Figure 1). Effektiv nukleära / cytoplasmic fraktionering snabbt kan bedömas av denaturering agarosgel analys (se figur 1). Bands correspond-ing to precursor rRNA should be equivalent in the total and nuclear RNA fraction. Bands motsvara-ing till precursor rRNA bör vara likvärdiga i den totala och nukleära RNA-fraktionen. The 18S and 28S rRNA bands will be less intense in the nuclear RNA fraction than in either total RNA or cytoplasmic fraction RNA. Den 18S och 28S rRNA-banden kommer att vara mindre intensiv i den nukleära RNA-fraktionen än i antingen total RNA eller cytoplasmic bråkdel RNA. In some cell lines, for example 293 and COS-7 cells, this difference will be dramatic, but in other cells lines such as HeLa cells, the rRNA bands are only slightly less intense in nuclear RNA than in total or cytoplasmic fraction RNA." I vissa cellinjer, till exempel 293 och COS-7 cells, denna skillnad kommer att vara dramatisk, men i andra celler linjer som hela celler, rRNA banden är bara något mindre intensiv med nukleära RNA än totalt eller cytoplasmic bråkdel RNA. "

RNA Purity RNA Renhetsgrad

A260 readings and 260/280 ratios are not enough to ensure high purity RNA. A260 läsningar och 260/280 kvoter är inte tillräckligt för att säkerställa hög renhet RNA. You must take a full UV spectrum. Du måste ta en hel UV-spektrumet. Below are 3 example spectra which all have good 260/280 ratios, but have very different purities. Nedan visas 3 exempel spektra som alla har goda 260/280 nyckeltal, men har mycket olika purities. You can also use the 260/230 ratio to help determine the amount of organic contamination in your RNA. Du kan också använda 260/230 förhållandet att hjälpa till att fastställa beloppet av organiska föroreningar i din RNA. It is a much more variable number than the 260/280 ratio, but generally, ratios above 1 indicate good purity. Det är en mycket mer varierande antal än 260/280 förhållandet, men generellt nyckeltal över 1 indikerar god renhet.

Quantifying RNA Extraction and Isolation Att beräkna RNA-extraktion och isolering

RNA Isolation from Subcellular Fractions RNA: Isolering från Subcellular Fractions

Cells were then washed in PBS and successively extracted as described. Cellerna har sedan tvättas i PBS och successivt utvinns som beskrivs. First, cells were extracted with the Nonidet P-40 buffer (10 mM Tris-Cl, (pH 7.5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). Först celler utvanns med Nonidet P-40-buffert (10 mM Tris-cl, (pH 7,5), 10 mM NaCl, 3 mm Mg Cl2, 0,5% (v / v) Nonidet P-40, 40 enheter / ml Rnasin, 1 mM DTT). The remaining pellet (rough endoplasmic reticulum (RER) and nucleus) was washed in the same buffer and extracted in buffer B (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 mM EDTA, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). De återstående pellet (rough endoplasmic reticulum (RER) och nucleus) var tvättas i samma buffert och utvinns i buffert B (10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 10 mM NaCl, 0,5% (v / v) Nonidet P-40 , 40 mM EDTA, 40 enheter / ml Rnasin, 1 mm DTT). The remaining nuclear pellet was washed in the same buffer and extracted with high salt buffer (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 3 mM MgCl2, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). De återstående nukleära pellet var tvättas i samma buffert och extraheras med hög salt-buffert (10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 0,5 M NaCl, 3 mm Mg Cl2, 0,5% (v / v) Nonidet P-40, 40 enheter / ml Rnasin, 1 mm DTT). RNA was purified from each fraction by the RNA STAT solution. RNA var renad från varje del av RNA-STAT lösning. Total RNA was isolated using the RNA-STAT60 reagent (Tel-test) according to the instructions provided by the manufacturer. Totalt RNA isolerades med hjälp av RNA-STAT60 reagens (Tel-test) enligt instruktionerna från tillverkaren. (Reference: Byeong-Churl Jang et al., 2002) (Referens: Byeong-tölp Jang et al., 2002)

RNA Isolation Using CsCl Protocol RNA: Isolering Använda CSCL protokoll

Chaos Buffer for RNA isolation Kaos buffert för RNA isolering

For 100 mls 200 mls För 100 MLS 200 MLS

4. 5M Guanidinium thiocyanate 53.2 g 106.4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM EDTA 0.5M 10 mls 20 mls 25mM Tris-HCl, pH 7.5 1M 2.5 mls 5 mls 5M guanidinium Thiocyanate 53,2 g 106,4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mm EDTA 0.5 miljoner euro 10 MLS 20 MLS 25mm Tris-HCl, pH 7,5 1M 2,5 MLS 5 MLS

0. 1M b-mercaptoethanol 700ul 1.4mls 1M b-merkaptoetanol 700ul 1.4mls

0. 2% antifoam A (Sigma) 200 ul 400 ul 2% antiskummedel A (Sigma) 200 ul 400 ul

5. 7 M CsCl cushion* Final Volume 100 ml 7 M CSCL dämpa * Final Volym 100 ml

5. 7 M "Baked" CsCl 95.8g 7 M "Varm" CSCL 95.8g

0. 1M EDTA 0.5M 20 mls 1M EDTA 0.5 miljoner euro 20 MLS

RNA Extraction Procedure Using CsCl RNA-extraktion Använda CSCL

* Use DEPC treated water and baked glassware. * Använd DEPC behandlas vatten och bakade glas. This solution, absolutely, positively must be Rnase free. Denna lösning, absolut, positivt måste Rnase fri. Rnase is everywhere! Rnase är överallt! Wear gloves, use only baked glassware, or virgin plastic. Använd handskar, använd bara ugnsbakad glasföremål eller jungfru plast. DePC treat your water, buffers (except Tris). DEPC behandla ditt vatten, buffertar (utom Tris). Be very careful. Var mycket försiktig.

1. Weigh animal. Väg djuret. Remove organ (liver), weight One of the superior attributes of cDNA is you reduce the gene complexity by choosing an organ that only expresses a single locus of a multilocus enzyme. Ta bort organ (lever), vikt En av de överlägsna egenskaper av cDNA är du minska gen komplexitet genom att välja ett organ som bara uttrycker ett enda ställe i en multilocus enzym. 2 . 2. Homogenize tissue rapidly in "Chaos" buffer (9mls) 3 . Homogenisera vävnaderna snabbt i "Kaos" buffert (9mls) 3. Spin homogenant at 12 KG to remove insoluble material 4 . Spin homogenant på 12 kg för att avlägsna olösliga material 4. WHILE Homogenant IS SPINNING 4A. MEDAN Homogenant IS SPINNING 4A. Weight out 1.8 g of CsCl (0.2g/ml) per sample. Vikt upp 1,8 g av CSCL (0.2g/ml) per prov. 4B. In the ultra-centrifuge tube ("quick-seal") add 3.5mls of 5.7M CsCl "cushion" This layer must be Rnase free. I de ytterst centrifugrör ( "quick-sigill") lägga 3.5mls av 5.7M CSCL "kudde" Detta skikt måste Rnase fri. You will centrifuge your RNA through this layer and any contamination will cause significant losses. Du kommer centrifugera din RNA genom detta lager och eventuella föroreningar kommer att orsaka betydande förluster. 5 . 5. Remove supernant, put into fresh tube, add 1.8 g CsCl 6 . Ta bort supernant, tas i färskt röret, tillsätt 1,8 g CSCL 6. Carefully, add homogenant on top of the CsCl cushion. Noga, lägg homogenant på toppen av CSCL dyna. This is most readily accomplished by using a 10cc syringe and long needle. Det är mest lätt uppnås genom att använda en 10cc spruta och lång nål. Place needle/syringe into quick-seal tube, and add tissue homogenant to the syringe. Placera nålen / sprutan i quick-sigillet rör och lägga vävnad homogenant till sprutan. Homogenant will slowly trickle into QS tube, floating on top of the cushion. Homogenant kommer sakta sippra in i QS provrör, flytande ovanpå de dyna.

7. Carefully, balance matched pairs of centrifuge tube (+/-0.005 g). Noga, balans matchade par centrifugrör (+ / -0,005 g).

8. Seal tubes, place matched tubes opposite of each other and cap with red aluminum tops. Seal-rör, plats matchade rör mittemot varandra och keps med röd aluminium toppar.

9. Centrifuge, 50,000 rpms 5.5 hrs, 20oC Centrifug, 50.000 rpms 5,5 timmar, 20oC

After centrifugation: Mark tubes where pellet should be: on the bottom outer side (relative to center of rotor) Efter centrifugering: Mark-rör där pelleten bör vara: på botten yttre sidan (i förhållande till centrum av rotorn)

10. Remove tubes, place in convenient rack. Ta bort rören, placera i bekväm rack.

11. Slice off the top of tube.Aspirate off the top 2/3- 3/4 of solution. Skiva ur början av tube.Aspirate off början 2/3- 3 / 4 av lösningen. WORK FROM THE TOP DOWN. WORK uppifrån. IT IS IMPORTANT THAT YOU ASPIRATE OFF THE UPPER MOST SOLUTION FIRST AND REMOVE ALL BUT THE CLEAR CUSHION. Det är viktigt att du Aspirera OFF DET HÖGRE MOST LÖSNING första och tar bort alla utom de tydliga dyna. DO NOT ASPIRATE THE INVISIBLE PELLET AT THE BOTTOM. INTE Aspirera OSYNLIGA PELLET längst ner.

12. Cut off the top 2/3 of tube. Avbröt början 2 / 3 av röret. Using a "pulled" Pasteur pipet, carefully remove remaining solution. Att använda en "drog" Pasteur-pipett, försiktigt bort återstående lösning. The pellet will be on the bottom-side of the tube. Pelleten kommer att vara på den nedre sidan av röret.

13. Rinse pellet with 70% EtOH, remove (use Pasteur pipets), repeat twice (total 3 washes) Skölj pelleten med 70% EtOH, ta bort (använd Pasteur pipets), upprepar två gånger (totalt 3 tvättar)

14. Add 200 ul of 0.1x TE (RNase free), using the pipet tip to crush pellet and "titrating" TE attempt to put pellet into solution. Tillsätt 200 ul av 0.1x TE (RNase gratis) med hjälp av pipett tips att krossa pelleten och "titrating" TE försök att sätta pelleten i lösningen. At least form a heterogeneous solution and put into a fresh microfuge tube. Åtminstone utgör en heterogen lösning och tas i en färsk mikrocentrifugrör röret.

15. Repeat with 200 ul of TE pooling both solutions Upprepa med 200 ul av TE samla både lösningar

16. Vortex, good RNA does not like to go into solution. Vortex, god RNA inte vilja gå in lösning. Patience is a virtue. Tålamod är en dygd.

17. Determine concentration, 10 ul into 490 ul (500 ul final vol) Bestäm koncentrationen, 10 ul till 490 ul (500 ul slutlig vol)

18. Remove 1 to 2 ug of RNA for gel analysis (add RNA loading buffers) Ta 1 - 2 ug av RNA för gel analys (lägg RNA lastning buffertar)

19. Add 1/10 volume Rnase free 3M NaOAC (40 ul), 2.5 volumes of EtOH (1.0ml). Tillsätt 1 / 10 volymprocent Rnase fria 3M NaOAC (40 ul), 2,5 volymer av EtOH (1.0ml). Mix vigorously. Blanda kraftigt.

20. You can calculate the concentration of RNA in the EtOH.Thus, there is no need to precipitate all of your RNA at once. Du kan beräkna koncentrationen av RNA i EtOH.Thus, finns det ingen anledning att fällningen alla dina RNA samtidigt. Just remove about 1.5 to 2 times the amount you need by vortexing EtOH/RNA solution and remove the appropriate volume. Just bort ungefär 1,5 till 2 gånger det belopp som du behöver genom att vortexa EtOH / RNA-lösning och ta bort den lämplig storlek. This EtOH/RNA solution stored at 20oC or lower, is stable for years. Detta EtOH / RNA-lösning förvaras vid 20oC eller lägre, är stabil i år.

See: Se:

RNA Protocols RNA-protokoll

RNA Bioinformatics RNA Bioinformatik