Welcome to Molecular Station! Välkommen till Molekylär Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du måste registrera dig innan du kan posta i vårt forum eller använda vår avancerade funktioner. Register Now! Registrera dig nu! Its Free and Fast! Dess fria och Snabbt!

Already registered? Redan registrerad? Login now below. Logga in nu nedan.

User Name: Användarnamn:

Password: Lösenord:

Remember Me? Kom ihåg mig?

Already registered and Forgot your password? Redan registrerad och Har du glömt ditt lösenord? Click below to recover it. Klicka nedan för att återkräva det.

Recover Lost Password Återskapa förlorat lösenord

Join now - it's fast and free! Gå med nu - det är snabbt och gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station är den största nätverk av forskare, vetenskapsmän och vetenskap älskare var som helst!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

RNA Protocols RNA-protokoll

RNA Encyclopedia RNA Encyclopedia

RNA Bioinformatics RNA Bioinformatik

RNA Forum RNA Forum

RNA Blog RNA Blog

RNA News RNA Nyheter

Northern Blot Northern Blot

Copyright 2007 - Molecular Station Copyright 2007 - Molecular Station

AUDIO AUDIO Listen to a detailed Northern Blot Explanation ! Lyssna till en detaljerad Northern Blot Förklaring!

History of Northern Blotting History of Northern blotting

Northern blotting is an RNA blotting technique which was developed in 1977 by Alwine et al. Northern blotting är en RNA blotting tekniken som utvecklades under 1977 genom Alwine et al. at Stanford University (ref:1). vid Stanford University (ref: 1). It was named after the Southern blot technique which blots for DNA, invented by Edwin M. Southern in 1975. Western blot , a method for blotting for proteins is also a play on the Southern blot naming and was named in 1981 (ref:2). Det har uppkallats efter Southern blot teknik som blotting för DNA, uppfanns av Edwin M. Södra 1975. Western blot, en metod för blotting för proteiner är också en pjäs om Södra blot namn och hette 1981 (ref: 2) .

Background Information - Northern Blot Technique Background Information - Northern Blot Technique

Northern analysis despite its age in the high tech world of Real Time PCR, nuclease protection assays (RPAs) and microarrays, is still the gold-standard for the detection and quantitation of mRNA levels. Northern analys trots sin ålder i högteknologisk värld av Real Time PCR, nuclease skydd analyser (RPAs) och microarrays, fortfarande är det guld-standard för detektering och quantitation av mRNA nivåer. This is because northern blot analysis allows a direct comparison of the messenger RNA abundance between samples on a single membrane. Detta beror Northern blot analys möjliggör en direkt jämförelse av budbärar-RNA överflöd mellan prov på ett enda membran.

In northern blot the main difference between the other blotting techniques is that RNA is the factor being detected. I norra blot den viktigaste skillnaden mellan de andra blotting tekniker är att RNA är den faktor som upptäckts. Also, due to the fact that RNA is usually single-stranded, it creates complex secondary structures which affect its migration and hence denaturing conditions are used to run the gels (unlike Southern). Dessutom, på grund av att RNA är vanligen enkelsträngat, det skapar komplexa sekundära strukturer som påverkar dess migration och därmed denaturering villkor används för att köra geler (till skillnad från södra).

RNA is separated out by RNA gel electrophoresis (usually agarose gel electrophoresis), subsequent transfer to membrane, hybridization with probe, and finally detection. RNA är separerade av RNA gelelektrofores (oftast agarosgel elektrofores), vidare överföring till membranet, hybridisering med sond och slutligen upptäckt.

Similarly to Southern blotting, the hybridization probes may be DNA or RNA in northern blotting. Likaså att Southern blotting, hybridisering sonder kan vara DNA eller RNA i norra blotting.

A variant of the procedure known as the reverse northern blot was occasionally (although, infrequently) used. En variant av det förfarande som kallas omvänd Northern blot var då och då (även om det sällan) användas. In this procedure, the substrate nucleic acid (that is affixed to the membrane) is a collection of isolated DNA fragments, and the probe is RNA extracted from a tissue and radioactively labelled. Vid detta förfarande substrat nukleinsyra (som är fäst på membranet) är en samling isolerade DNA-fragment, och sonden är RNA extraheras från ett papper och radioaktivt märkta.

The use of DNA microarrays that have come into widespread use in the late 1990s and early 2000s is more akin to the reverse procedure, in that they involve the use of isolated DNA fragments affixed to a substrate, and hybridization with a probe made from cellular RNA. Användningen av DNA microarrays att få komma i allmänt bruk i slutet av 1990-talet och början av 2000-talet är mer att likna vid det omvända förfarandet, genom att inbegripa användning av isolerade DNA-fragment anbringas på ett substrat, och hybridisering med en sond gjord av porös RNA . Thus the reverse procedure, though originally uncommon, enabled the one-at-a-time study of gene expression using northern analysis to evolve into gene expression profiling, in which many (possibly all) of the genes in an organism may have their expression monitored Alltså det omvända förfarandet, men ursprungligen ovanligt, gjort det möjligt för en-till-en-dags studier av genuttryck med hjälp norra analys att utvecklas till gene expression profiling, där många (kanske alla) av generna i en organism kan ha sina uttryck övervakas

Applications of the Northern Blot Ansökningar av Northern blot

Northern blots have been superceded in most areas by Real Time PCR and microarray approaches. Northern blotting har ersatts på de flesta områden av Real Time PCR och microarray-metoder. It is not often used for clinical or diagnostic purposes. Det är inte ofta används för kliniska och diagnostiska syften.

The northern blot protocol and its variations are used however in molecular biology research to: The Northern blot-protokollet och dess varianter används dock i molekylärbiologisk forskning till:

• a gold-standard for the direct study of gene expression at the level of mRNA (messenger RNA transcripts). en guld-standard för den direkta studier av genuttryck på mRNA (budbärar-RNA transkribering).
• detection of mRNA transcript size detektion av mRNA transcript storlek
• study RNA degradation Studien RNA nedbrytning
• study RNA splicing - can detect alternatively spliced transcripts Studien RNA splitsning - kan upptäcka alternativt kantskarvat transkriptioner
• study RNA half-life Studien RNA halveringstid
• study IRES (internal ribosomal entry site) - to remove possibility of RNA digestion vs 2nd cistron translation. Studien IRES (intern ribosomala inresa site) - ta bort möjligheten att RNA matsmältning vs 2:a Cistron översättning.
• often used to confirm and check transgenic / knockout mice (animals) ofta används för att bekräfta och kontrollera transgena / knockout-möss (djur)

Disadvantages of Northern Blotting Nackdelar of Northern blotting

The disadvantages of using northern blotting include: De nackdelar med att använda norra blotting inkluderar:

• Often radioactivity is used. Ofta radioaktivitet används. This prevents ease of performing it, use and disposal. Detta förhindrar lätthet att utföra det, användning och bortskaffande. New methods of non-radioactive detection have been generated allowing non-radioactive detection. Nya metoder för icke-radioaktiva upptäckt har framkallats tillåter icke-radioaktiva upptäckt. See Pierce. Se Pierce.
• The whole process of northern blotting takes a long time usually, from sample preparation through to detection. Hela processen av norra blotting tar lång tid brukar, från provberedning genom att upptäcka.
• If RNA samples are even slightly degraded by RNases, the quality of the data and quantitation of expression is quite negatively affected. Om RNA-prover är ännu mindre omfattning av RNases, uppgifternas kvalitet och quantitation yttrandefriheten är ganska negativt.
• The standard northern blot method is relatively less sensitive than nuclease protection assays and RT-PCR. Standarden Northern blot-metoden är relativt sett mindre känsliga än nuclease skydd analyser och RT-PCR. The sensitivity of northern blots may be increased with the use of nylon positively-charged membranes, use of a highly specific antisense probe. Känsligheten i norra blotting kan ökas med hjälp av nylon positivt laddade membran, användning av en mycket specifik antisens-sond.
• Detection with multiple probes is a problem. Detektion med flera sonder är ett problem. Often, the membranes must be stripped before hybridization and detection with a second probe. Ofta är det membran måste demonteras innan hybridisering och detektion med en andra sond. This is a problem as harsh conditions are required to strip off probes from the blot and is also time consuming. Detta är ett problem som svåra förhållanden är skyldiga att tömma ut sonder från blot och är också tidskrävande. Also, there is a limit to the amount of times a blot may be stripped. Dessutom, det finns en gräns för hur mycket tid en skamfläck kan demonteras.

Advantages of Northern Blotting Fördelar med Northern blotting

The advantages of northern blots include: Fördelarna med norra blotting inkluderar:

• It is a widely accepted and well regarded method Det är ett allmänt accepterat och väl betraktas metod
• northern blotting is a straight-forward method norra blotting är en rakt-fram-metoden
• Often it is used as a confirmation or check Ofta är det användas som en bekräftelse eller kontrollera
• Often a gold-standard Ofta en guld-standard
• it is a versatile protocol as it can allow the usage of many types of probes (vs Real time PCR) including: radiolabeled and non-radiolabeled, in vitro transcribed RNA and even oligonucleotides such as primers. Det är en mångsidig protokoll som det kan låta användningen av många typer av sonder (vs Real time PCR) inklusive: radioaktivt och icke radioaktivt, in vitro-RNA transkriberas till och med oligonucleotides såsom grundfärg.
• Sequences with even partial homology, unlike real time PCR or other methods can be used as hybridization probes (ie sequence from different species for homology analysis, or even genomic fragments can be used). Sekvenser med ens delvis homology, till skillnad från real time PCR eller andra metoder kan användas som hybridisering sonder (dvs sekvenser från olika arter för homology analys, eller ens genomic fragment kan användas).

Northern Blot Protocol Northern Blot protokoll

As mentioned the steps in northern blotting include: Som nämnts stegen i norra blotting inkluderar:

1. RNA isolation RNA isolering
2. Gel electrophoresis of RNA for separation Gelelektrofores av RNA för separation
3. Transfer to membrane (usually positively charged nylon as RNA is negatively charged) Överföring till membranet (vanligtvis positivt laddade nylon som RNA är negativt laddad)
4. Cross-linking of RNA to membrane (usually by UV-crosslinking or chemical means) Cross-linking av RNA till membranet (vanligen genom UV-crosslinking eller kemisk väg)
5. Hybridization Hybridisering
6. Detection

Materials Needed for Northern Blot Protocol Material som behövs för Northern Blot protokoll

Buffer Recipes Buffer Recept

20XSSPE (500 ml) 20XSSPE (500 ml)

• 3.6M NaCl : 105.2 g 3.6M NaCl: 105,2 g
• 0. 2M phosphate buffer pH 7.0: 100mL of 1M 2M fosfatbuffert pH 7,0: 100 ml av 1M
• 20mM EDTA: 20mL of 0.5M 20mm EDTA: -20 ml av 0.5 miljoner euro

Phosphate buffer pH7.0 (500ml) Fosfatbuffert pH7.0 (500 ml)

• NaH2PO4 (monobasic) 140 mL of 1M NaH2PO4 (monobasiskt) 140 mL 1M
• Na2H2PO4 (Dibasic) 360 mL of 1M Na2H2PO4 (Dibasic) 360 mL 1M
• pH to 7.0 after both are added pH till 7,0 efter både tillsätts

Hybridization buffer =HB (100mls) Hybridiseringsbuffert = HB (100mls)

• 5X SSPE: 25mls 20X 5x SSPE: 25mls 20X
• 2% SDS: 20 mls 10% 2% SDS: 20 MLS 10%

* *Right before using add 1000ug denatured RNAse free CT DNA (heat to 95o for 3 min to denature) 5000ug yeast RNA * * Rätt innan du använder lägga 1000ug denaturerad RNAse fria CT DNA (värme till 95o för 3 min att denaturera) 5000ug jäst RNA

WASH: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls 20X 5 mls 10% SDS= 0.1% SDS WASH: 2X SSPE + 0,1% SDS (500 MLS) 50 MLS 20X 5 MLS 10% SDS = 0,1% SDS

Running buffer for RNA gel (1L) Running buffert för RNA gel (1L)

• 100 mls 10X MOPS 100 MLS 10X MOPS
• 52. 6 mls of formaldehyde 6 MLS formaldehyd
• 847. 4 mls H20 4 MLS H20

RNA Gel (70ml) RNA-Gel (70ml)

• 0.84 g agarose 0,84 g agaros
• 7 mls 10x MOPS 7 MLS 10x MOPS
• 58.38 mls H2O 58,38 MLS H2O
• Put gel in solution by heating. Sätt gel i lösningen av värme. Let gel cool to 60°C, then add Formaldehyde to equal 0.66M --3.78 mls Låt gelen svalna till 60 ° C, sedan lägga Formaldehyd till lika 0.66M - 3,78 MLS
• Pour gel in fume hood if possible Häll gelen i ånga huva om möjligt

RNA Samples for Northern Blot RNA Prover för Northern Blot

See RNA Isolation and Purification Se RNA Isolering och rening

RNA Gel RNA-Gel

After isolating RNA, the RNA must be separated out on a gel (usually agarose). Efter att isolera RNA, RNA måste skiljas ut i en gel (vanligtvis agaros).

see RNA gels se RNA geler

Northern Blot Transfer to Nylon Membrane Protocol Northern Blot Överföring till Nylon Membrane protokoll

After running the RNA gel , wash the gel with distilled water put on posiblotter. Efter att ha kört RNA gel, tvätta gel med destillerat vatten upp på posiblotter.

Layers from top to bottom are: Lager, uppifrån och ner:

• sponge svamp
• 3-4 Whatman papers cut to size ( both of these up above should be soaked in 10X SSPE but not dripping) 3-4 Whatman papers kapas till storlek (båda dessa upp ovan bör blötläggas i 10X SSPE men inte droppande)
• gel mask. gel mask.
• Note: Make sure the gel overlays the mask so that it can seal membrane with line of the top of gel and the right top corner marked 3 pieces slightly bigger 3M paper hard plastic with holes OBS: Se till att gelen överlagring masken så att den kan tätningen membran med raden i början av gel och rätten övre hörnet märkt 3 stycken något större 3M papper hårdplast med hål

Clamp on and make sure there is a good seal. Clamp på och se till att det finns en god tätning. Use 75-80 mm Hg of pressure for 1 hr or more. Använd 75-80 mm Hg i tryck i 1 tim eller mer.

Blot membrane dry Blot membrane torrt

Cross-linking Nylon Membranes - Northern Blot Protocol Cross-linking Nylon Membranes - Northern Blot protokoll

• Cut top right corner wrap in saran wrap. Cut övre högra hörnet wrap i Saran Wrap.
• UV irradiate with RNA side down for 2.5 min. UV-bestråla med RNA ner till 2,5 min.
• Wash for a couple of minutes in hot 2X SSPE/0.1% SDS solution (Microwave solution for 30-45 seconds at 50% power. Tvätta i ett par minuter i varmt 2X SSPE/0.1% SDS-lösning (Microwave lösning för 30-45 sekunder vid 50% effekt.
• Air dry Air dry

Pre Hybridization for Northern Blot Pre hybridisering för Northern Blot

1. Pre Hybridize for 6 hours-overnight Pre hybridiseras till 6 timmar och övernattning
2. Set oven to 65°C heat HB buffer to put SDS in solution Sätt ugnen till 65 ° C värme HB buffert för att sätta SDS i lösning
3. Roll up membrane inside piece of mesh and put into hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS) Rulla ihop membranet inuti bit armeringsnät och tas i hybridizaton röret (2X SSPE/0.1% SDS)
4. Check for air bubbles Kontrollera om luftbubblor
5. Put tube in oven balanced with another tube on opposite side Placera röret i ugn balanserad med en annan tub på motsatt sida

Labeling probe for Northern Blotting Märkning sond för Northern blotting

1. Put 25ng of probe in a total volume of 11uL with ddH2O Sätt 25ng av sonden i en total volym på 11uL med ddH2O
2. Denature @ 95°C 3 min. Denaturera @ 95 ° C 3 min. This is to get the probe single stranded and remove secondary structure which would prevent efficient hybridization. Detta för att få sonden enkelsträngade och ta bort sekundärstrukturen, vilket skulle förhindra effektiv hybridisering.
3. Quick cool on wet ice. Quick svalna på våt is. This is to keep the probe single stranded, free of secondary structure and not allow reannealing (or reforming of secondary structures). Detta är att hålla sonden enkelsträngade, utan sekundär struktur och inte tillåta reannealing (eller reformering av sekundära strukturer).
4. Add 4ul High Prime (Boehringer Mannheim) 5ul alpha radiolabeled P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul total Lägg 4ul High Prime (Boehringer Mannheim) 5ul alfa radioaktivt P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul totalt
5. Incubate 10-15 min 37°C Inkubera 10-15 min 37 ° C
6. Add 28uL of 1X TE, 2ul 0.5M EDTA, to 20ul reaction. Lägg 28uL 1X TE, 2ul 0.5 miljoner euro EDTA, till 20ul reaktion.
7. Pre-spin G-25 Sephadex column for 1 minute. Pre-spin G-25 Sephadex kolumn i 1 minut.
8. Add 50ul sample to column and spin for 2.5 min in clinical centrifuge. Lägg 50ul provet till kolonnen och spinn för 2,5 minut i kliniska centrifug. This is to purify probe away from label. Detta är rena sonden bort från etiketten.
9. Throw away column. Kasta bort kolumn.
10. Mix in a new tube 100ug CT-DNA 50ug Yeast RNA in a 0.5mL tube. Blanda i en ny tub 100ug CT-DNA 50ug Yeast RNA i ett 0,5 ml rör.
11. Denature 95° 3 min Denaturera 95 ° 3 min
12. Add to hybrid tube mix, hybridize at 65°C for 20-36 hrs Lägg till hybrid röret mix, hybridiseras vid 65 ° C under 20-36 timmar

Post hybridization Protocol for Northern Blotting Post hybridization protokoll för Northern blotting

Hybridize for 36-48 hours then wash. Hybridiseras till 36-48 timmar sedan tvätta.

1. Heat up 2X SSPE/0.1% SDS (wash) heat up to 65° C (Use microwave or water bath to warm solution) Värm upp 2X SSPE/0.1% SDS (tvätt) värme upp till 65 ° C (Använd mikrovågsugn eller vattenbad för att värma lösningen)
2. Take out tube and pour liquid into hot radioactive waste container. Ta ur röret och häll vätskan i varma radioaktivt avfall container.
3. Rinse with 10ml wash do this twice and pour waste out. Skölj med 10 ml tvätta göra det två gånger och häll avfall.
4. Put in 40 to 50 mls of wash and shake vigoursly. Lägg i 40 - 50 MLS av tvätt och skaka vigoursly.
5. Put in hybridization oven for 20 min rotating. Lägg i korsning ugnen i 20 min roterande.
6. Pour down sink Häll ner sjunker
7. Another 40-50mls and shake in oven. En annan 40-50mls och skaka i ugnen.
8. Pour out to waste container (sink if not hot or toxic) and make sure it is no longer hot and then take out membrane. Häll ut till avfallsbehållare (sjunka om inte heta eller giftiga) och se till att det inte längre är heta och sedan ta ut membranet.
9. Wash on shaker with 0.2XSSPE w/ 0.1% SDS at RT for 15 min. Tvätta i shaker med 0.2XSSPE w / 0,1% SDS i RT för 15 min.
10. Air dry Air dry
11. Expose

Tips for Northern Blot Tips för Northern Blot

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Om du har ett föredra för att isolera RNA, fortsätta att använda den.

Always run an agarose gel of your RNA to assess the quality. Alltid köra en agarosgel i din RNA att bedöma kvaliteten. Do not only rely on spectrophotometry results. Ta inte bara förlita sig på spectrophotometry resultat.

* Use DEPC treated water and baked glassware. * Använd DEPC behandlas vatten och bakade glas. This solution, absolutely, positively must be Rnase free. Denna lösning, absolut, positivt måste Rnase fri. Rnase is everywhere! Rnase är överallt! Wear gloves, use only baked glassware, or virgin plastic. Använd handskar, använd bara ugnsbakad glasföremål eller jungfru plast. DePC treat your water, buffers (except Tris). DEPC behandla ditt vatten, buffertar (utom Tris). Be very careful. Var mycket försiktig.

Troubleshooting Northern Blots Felsökning Northern blotting

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Om du har ett föredra för att isolera RNA, fortsätta att använda den.

Discuss and post questions about this in the Northern Blot Forum . Diskutera och ställ frågor om detta i den nordliga Blot Forum.

Northern Blot References Northern Blot Referenser

1. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes". "Metod för detektion av specifika RNAs i agarose gels genom överföring till diazobenzyloxymethyl-papper och hybridisering med DNA-sondstekniken". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (12): 5350-4. USA 74 (12): 5350-4.
2. W. Neal Burnette (April 1981). W. Neal Burnette (april 1981). "'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate — polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A". "" Western blotting ": elektrofores överföring av proteiner från natriumdodecylsulfat - polyacrylamide gels till oförändrade nitrocellulosa och radiografi upptäckt med antikropp och radioiodinated protein A". Anal Biochem 112 (2): 195-203. Anal Biochem 112 (2): 195-203.