Welcome to Molecular Station! Välkommen till Molekylär Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du måste registrera dig innan du kan posta i vårt forum eller använda vår avancerade funktioner. Register Now! Registrera dig nu! Its Free and Fast! Dess fria och Snabbt!

Already registered? Redan registrerad? Login now below. Logga in nu nedan.

User Name: Användarnamn:

Password: Lösenord:

Remember Me? Kom ihåg mig?

Already registered and Forgot your password? Redan registrerad och Har du glömt ditt lösenord? Click below to recover it. Klicka nedan för att återkräva det.

Recover Lost Password Återskapa förlorat lösenord

Join now - it's fast and free! Gå med nu - det är snabbt och gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station är den största nätverk av forskare, vetenskapsmän och vetenskap älskare var som helst!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

Bookmark Bookmark Site Bookmark Bookmark Site

Real-time PCR Real-time PCR

Real time and Quantitative PCR Realtid och kvantitativa PCR

Introduction to Real-Time PCR Introduktion till Real-Time PCR

Real-time PCR is a type of quantitative PCR which measures the amount of cDNA or mRNA in a sample, either from a population of cells (tissue or cell culture), or recently even from a single cell. Real-time is used commonly to determine the expression of a gene's mRNA, and its expression levels (copy number of mRNA) during certain conditions (such as treating cells with a drug).  Real-time PCR can be used to compare normal (control) samples to disease samples, giving an idea as to expression changes which occur with pathogenesis.  Real-time PCR due to its sensitivity is also used in the detection of pathogens in the blood such as viruses. Real-time PCR är en typ av kvantitativa PCR som mäter mängden cDNA eller mRNA i ett prov, antingen från en population av celler (vävnad eller cellodling), eller nyligen även från en enda cell. Realtid används vanligtvis till bestämma uttrycket av en gen s mRNA, och dess uttryck nivåer (Antal kopior av mRNA) under vissa villkor (såsom att behandla celler med en drog). Real-time PCR kan användas för att jämföra normal (kontroll) prover till sjukdom prover, ge en idé som till uttryck förändringar som skett med patogenes. Real-time PCR på grund av sin känslighet används också för att upptäcka patogener i blodet som virus.

The development of real-time quantitative PCR has eliminated the variability traditionally associated with quantitative PCR, thus allowing the Utvecklingen i realtid kvantitativa PCR-slopade den variabilitet som traditionellt förknippas med kvantitativa PCR, vilket gör att
routine and reliable quantitation of PCR products. rutinmässiga och tillförlitlig quantitation av PCR-produkter.

Table of Contents Innehåll

Introduction to Real-time PCR Introduktion till Real-time PCR

Real Time PCR: Advantages of Real-time PCR Real Time PCR: Fördelar med Real-time PCR

History of Real-Time PCR History of real-time PCR

Real-time PCR systems Available Realtids-PCR-system ledig

Real-time PCR Protocols Realtids-PCR-protokoll

Mechanism of Real-time PCR Mekanismen i Real-time PCR

Real Time PCR: Advantages of Real-time PCR Real Time PCR: Fördelar med Real-time PCR

Each cell type expressess a set of mRNA molecules, known as a transcriptome.  In response to stimuli, cells are able to up-regulate or down-regulate factors such as protein enzymes inside the cell by regulating the mRNA levels of these factors.  mRNA levels are not always correlated with protein levels so some caution is necessary, however generally mRNA levels do loosely correspond to protein levels.  Measuring the mRNA levels of certain factors inside a cell using real-time pcr is a method which will give clues as to the amounts of these factors or proteins. Varje celltyp expressess ett antal mRNA-molekyler, som kallas transcriptome. Som svar på stimuli, celler kan upp-reglera eller ner-reglera faktorer såsom protein enzymer inuti cellen genom att reglera mRNA nivåerna av dessa faktorer. MRNA nivåer inte alltid korrelerar med protein nivåer så viss försiktighet är emellertid nödvändigt allmänhet mRNA nivåer göra löst motsvara protein nivåer. mäta mRNA nivåer av vissa faktorer inuti en cell med hjälp av realtids-PCR är en metod som kommer att ge ledtrådar till de belopp av dessa faktorer eller proteiner.

Traditionally, mRNA levels inside the cell were measured using Northern blotting.  This technique is regarded as a gold-standard in the measurement of gene expression/mRNA levels as it uses radiolabeled probe to label the RNA, which is then quantified using a scintillation counter giving very accurate readings. Traditionellt mRNA nivåer inuti cellen mättes med hjälp av Northern blotting. Denna teknik betraktas som en guld-standard på mätning av genuttryck / mRNA nivåer eftersom det använder radioaktivt sonden att märka det RNA som sedan kvantifieras med hjälp av ett scintillation counter ge mycket noggranna avläsningar. Northern blotting although very accurate had several disadvantages including the use of radioactivity. Northern blotting men mycket exakt hade flera nackdelar inklusive användningen av radioaktivitet. Northern blotting required the accurate measurement of mRNA and total RNA from cells extracted in order to compare samples. Northern blotting krävs det noggrann mätning av mRNA och totala RNA från celler utvunna för att jämföra prover. This was a problem because although detection methods were very accurate, error could be introduced into Northern blotting (or RNA dot/slot blotting) through differences in total RNA/mRNA levels between samples (ie cell treatments, different tissues, different animals, etc.).  It also required relatively large amounts of RNA which required large numbers of cells. Detta var ett problem eftersom även om detektionsmetoder var mycket noggrann, fel kan föras in Northern blotting (eller RNA dot / slot blotting) genom skillnader i totala RNA / mRNA nivåer mellan prover (dvs. cell behandlingar, olika vävnader, olika djur, etc. ). Vidare krävs relativt stora mängder RNA som krävde ett stort antal celler. Recently, mRNA gene quantification or real-time pcr methods have been improved and are easier to perform and do not require the use of radioactivity.  Researchers often only have access to small amounts of cells especially in the fields of stem cell research and primary cell research, and real-time pcr has made it possible to quantify mRNA levels from even very small numbers of cells and lately even single cells.  However, this extreme sensitivity of real-time pcr methods makes it vital to protect one's samples from contamination, which would lead to false results. Nyligen mRNA gen kvantifiering eller realtids-PCR-metoder har förbättrats och är enklare att utföra och inte kräver användning av radioaktivitet. Forskare som ofta bara har tillgång till små mängder celler särskilt inom stamcellsforskning och primära cell forska Och realtids-PCR har gjort det möjligt att kvantifiera mRNA nivåer från och med mycket små mängder celler och senare även enstaka celler. Men denna extrema känslighet för realtids-PCR-metoder gör det absolut nödvändigt att skydda den egna prover från smitta, vilket skulle leda till felaktiga resultat. Current real-time pcr methods and systems also do not require the measurement of mRNA or cDNA sample concentrations before real-time pcr is conducted. Aktuella realtids-PCR-metoder och system också kräver inte mätning av mRNA eller cDNA prov koncentrationer före realtids-PCR genomförs.

History of Real-Time PCR History of real-time PCR

Higuchi et al.1,2 pioneered the analysis of PCR kinetics by constructing a system that detects PCR products as Higuchi et al.1, 2 banat väg för analys av PCR-kinetik genom att konstruera ett system som upptäcker PCR-produkter som
they accumulate. de samlas. This “real-time” system includes the intercalator ethidium bromide in each amplification reaction, Denna "realtid" Systemet omfattar de intercalator etidiumbromid i varje amplifiering reaktion,
an adapted thermal cycler to irradiate the samples with ultraviolet light, and detection of the resulting fluorescence en anpassad termocykler för bestrålning av prov med ultraviolett ljus, och upptäckt av den resulterande fluorescence
with a computer-controlled cooled CCD camera. med en dator-styrd kyls CCD-kameran. Amplification produces increasing amounts of double-stranded Amplification ger ökad mängd double-stranded
DNA, which binds ethidium bromide, resulting in an increase in fluorescence. DNA, som binder etidiumbromid, vilket resulterar i en ökning av fluorescensen. By plotting the increase in fluorescence Genom att rita den ökade fluorescensen
versus cycle number, the system produces amplification plots that provide a more complete picture of the kontra cykeln antal, systemet producerar amplifiering tomter att ge en mer fullständig bild av
PCR process than assaying product accumulation after a fixed number of cycles. PCR-processen än att analysera produkten ansamlingen efter ett fastställt antal gånger.

External sites: see Real Time PCR at Real Time PCR Info! Externa webbplatser: se Real Time PCR i realtid PCR Info!

References for Real-Time PCR Hänvisningar till real-time PCR

1. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, PS, and Griffith, R. 1992. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, PS, och Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Samtidig amplifiering och detektion av specifika DNA-sekvenser.
Biotechnology 10:413–417. Biotechnology 10:413-417.

2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R. 1993. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., och Watson, R. 1993. Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions. Kinetic PCR: realtid övervaka DNA-amplifiering reaktioner.
Biotechnology 11:1026–1030. Bioteknik 11:1026-1030.

Real-Time PCR Protocols Realtids-PCR-protokoll	Real-Time PCR Bioinformatics and Databases Real-time PCR bioinformatik och databaser	Learn about Real-Time PCR Läs om real-time PCR	Real-Time PCR Kits and Products Real-time PCR Kits och Produkter	Real-Time PCR Forum Real-time PCR Forum	Real-Time PCR Books Real-time PCR Böcker