home > protein > troubleshooting-western-blots > index.php hem> protein> felsökning-western-blotting> index.php
 |
|---|
The Molecular Station Guide to Western Blotting Problems and Solutions: Common Western Blot Problems and Solutions for them! De molekylära Station Guide till Western blotting problem och lösningar: Gemensam Western Blot problem och lösningar för dem!
Please Contact Us with your ideas if you can add to this guide. Kontakta oss med dina idéer om du kan lägga till denna guide.
Membrane is Glowing in the Dark Room Membrane är Glowing in the Dark Room
Too many Bands in Western Blot Alltför många band i Western Blot
Troubleshooting Western Blots Problem: Felsökning Western blotting Problem:
Spots on Film (missing bands) : Spots på film (försvunna banden):
- Poor Transfer due to air bubbles during transfer to membrane -- Poor Överlåtelse på grund av luftbubblor under överföring till membranet
- dirty film when adding to the developer -- Dirty film när du lägger till byggherren
- developer rolls are dirty -- Exploatören rullar är smutsig
Solution to spots on film: Lösning på fläckar på film:
- use a pasteur pipette as a roller. -- Använda en Pasteur-pipett som en vals. roll the membrane and gel before transfer to remove bubbles. rulle membranet och gel före överföringen ta bort bubblor. keep membrane and materials wet. hålla membranet och material vått.
- keep film clean before adding to the developer -- Föra film rena innan du lägger till byggherren
Troubleshooting Western Blots Problem: Felsökning Western blotting Problem:
Too Many Bands in Western Blot : Too Many Bands i Western Blot:
- usually due to many non-specific bands -- Oftast på grund av att många icke-specifika band
- poor primary antibody quality or old antibody -- Poor primära antikroppen kvalitet eller gamla antikropp
- not enough blocking -- Inte tillräckligt blockering
- proteolytic cleavage of antigen - all additional bands are lower MW than your protein, ( ie your protein is being detected but was degraded) -- Proteolytiska klyvning av antigener - alla Ytterligare band är lägre MW än din protein, (dvs ditt protein som upptäckts men var förstörd)
Solutions to too many bands on western blot: Lösningar på alltför många band i Western Blot:
- purchase another antibody or replace with a fresh antibody stock -- Köp en annan antikropp eller ersätta med en ny antikropp bestånd
- block with 5% dry non-fat milk or BSA prior to adding primary. -- Block med 5% torr fettfri mjölk eller BSA före lägga primära. If you are already blocking, consider blocking during primary and secondary antibody incubations and also increasing blocking milk or BSA concentration. Om du redan blockering, anser blockering vid primär och sekundär antikropp inkubation och även öka blockering mjölk eller BSA koncentration.
- keep everything on ice, use fresh samples, store in - 80C, and use protease inhibitors such as PMSF -- Håller allt på is, använd färska prover, lagra in - 80c och använder proteashämmare såsom PMSF
Troubleshooting Western Blots Problem: Felsökning Western blotting Problem:
High background; low signal to noise ratio on Western Blot Hög bakgrund, låg signal / brusförhållande på Western Blot
- black or every dark film; film was exposed too long -- Svart eller vart mörk film, filmen var exponerade för lång
- blocking was insufficient ; non-specific binding of primary antibody and secondary antibodies were not washed completely -- Blockering var otillräckligt, icke-specifik bindning av primär antikropp och sekundära antikroppar var inte tvättas helt
- washing was insufficient -- Tvättning var otillräcklig
- film glows in dark! -- Film lyser i mörkret! - too high secondary or primary dilutions -- För hög sekundär eller primär utspädningar
Solutions to Dark Film: Lösningar på Dark Film:
- expose for less time, decrease exposure time -- Utsätt för kortare tid, minskar exponeringen tid
- increase blocking duration of non-fat dry milk 5% incubation or increase the concentration. -- Öka blockering varaktighet fettfri mjölktorrsubstans 5% inkubation eller öka koncentrationen.
- also you can try blocking with whole serum of the host animal with (or before) the secondary antibody -- Också kan du försöka blockera med hela serum i värdlandet djur med (eller före) den sekundära antikroppen
- increase washing times and volumes to help remove any non-specific signal due to weak antibody binding. -- Öka tvätt-tider och volymer för att ta bort alla icke-specifik signal på grund av svaga antikroppar bindande.
- using a stronger detergent to wash - Instead of TBST (Tween-20), use stronger detergents such as NP-40 or SDS which may provide a more stringent wash and reduce background (do this only if you band is strong! - washing also removes some your band of interest!) -- Med hjälp av en starkare rengöringsmedel för att tvätta - Istället för TBST (Tween-20), använder starkare rengöringsmedel såsom NP-40 eller SDS som kan ge en strängare tvätta och minska bakgrund (gör detta endast om du bandet är stark! - Tvätta också tar bort en del ditt band av intresse!)
- very high secondary antibody (or even primary) concentration - perform optimization experiments to determine proper antibody dilutions. -- Mycket hög sekundär antikropp (eller ens primärt) koncentration - utföra optimering experiment för att bestämma lämplig antikropp utspädningar. dilute the antibodies further. späd antikropparna ytterligare.
Troubleshooting Western Blots Problem: Felsökning Western blotting Problem:
Low Signal or Weak Signal Låg signal eller svag Signal
- due to not enough protein loaded on the gel -- På grund av inte tillräckligt protein lastas på gelen
- primary antibody is old or not good -- Primär antikropp är gammal eller inte bra
- phospho-proteins usually need overnight primary antibody incubation -- Phospho-proteiner oftast behöver övernattning primära antikroppen inkubering
- not enough secondary antibody -- Inte tillräckligt sekundär antikropp
- over-blocking -- Over-blockerande
- developing reagents are bad / you made a mistake when preparing them -- Utveckla reagens är dåliga / ni gjorde ett misstag när de förbereder dem
Solutions to Low Signal or Weak Signal : Lösningar på Låg signal eller svag Signal:
- load more protein sample onto gel -- Lasten mer protein prov på gel
- try fresh primary antibody -- Försök färska Primary Antibody
- incubate primary antibody overnite for phosphoproteins at 4 degrees C (cold room shaker) -- Inkubera primära antikroppen overnite för phosphoproteins vid 4 grader C (kylrum shaker)
- increase concentration of protein (lyse samples in less lysis buffer) -- Öka koncentrationen av protein (Lyse prov i mindre lyseringsbuffert)
- decrease concentration of blocking agent -- Minska halten av blockerande agent
- check the developing reagents; prepare fresh ECL and re-ECL the membrane -- Kontrollera att utveckla reagens; förbereda färska ECL och re-ECL membranet
- increase the concentration or the length of primary antibody incubation period -- Öka koncentrationen eller längden av primär antikropp inkubationstid
- increase concentration or the length of secondary antibody incubation period -- Öka koncentrationen eller längden av sekundär antikropp inkubationstid
Fuzzy Bands, Bands Smeared, Bands not Sharp Fuzzy Band, Band smetig, Bands inte Sharp
- bands smeared due to hot gel -- Band smetig på grund av varm gel
- bands fuzzy due to high voltage -- Band fuzzy på grund av högspänning
Solutions to Fuzzy bands and Un-sharp Bands: Lösningar på Fuzzy banderoller och Un-skarpa Bands:
- decrease voltage or current, run in cold room, and prepare new running buffer. -- Minskningen spänning eller ström, köra i kylrum och förbereda nya kör-buffert. ( heat causes the gel to lose its rigidity and its resolving power) (Värme orsakerna gelen förlorar sin styvhet och dess upplösning)
- pre-soak transfer membrane in the appropriate transfer solution (determined by the membrane manufacturer) for the required length of time. -- Pre-blöta överföring membranet i lämplig överföring lösning (bestäms av membranet tillverkaren) för det krävs lång tid.
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Disclaimer / Terms of Service | Privacy policy | © 2005-2007 Molecular Station.com, Alla rättigheter reserverade.
Send this page to a friend Skicka denna sida till en vän
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
