Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Bioinformatik, protokoll, DNA-RNA-Protein Proteomics

Biology Home Protocols Bioinformatic Tools Biology Forums Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark Us! Biologi Hem protokollen bioinformatiska verktyg Biologi Forums molekylärbiologi Encyclopaedia molekylärbiologi Bilder Bookmark Us!

home > protein > protein-protocols > western-blotting > index.php hem> protein> protein-protokoll> western-blotting> index.php

Molecular Biology Home Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomics Research BETA! Bioinformatics Lab Equipment Molecular Biology Techniques Molecular Biology Products and Services Related Biology Links Molekylärbiologi Hem Science News Science Videos DNA-RNA-Protein Proteomics Research BETA! Bioinformatik Lab Utrustning molekulära molekylärbiologi produkter och tjänster relaterade Biologi Länkar

Molecular Biology Blog Molekylärbiologi Blog

Send this page to a friend Skicka denna sida till en vän

Intracellular Stations Inre Stationer

Antibody Botany Common Buffers Buffers Alphabetic Bookstore Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis Histology Microarrays Immunology Mass Spectrometry Microbiology Molecular Imaging Peptide Proteomics Protein Microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi and SiRNA Stem Cell Biology Transfection Western Blot Antibody botanik gemensamma Buffers Buffers Alphabetic Bookstore cellbiologi och kultur gelelektrofores Histologi Microarrays Immunologi Mass Spectrometry mikrobiologi Molecular Imaging Peptide Proteomics Protein Microarray Chips PCR real-time PCR RNAi och SiRNA stamceller transfektion Western Blot

Western Blot Western Blot

Western Blot Protocols Western Blot protokoll

Western Blot Forum Western Blot Forum

Western Blot Products Western Blot Produkter

Western Blot Books Western Blot Böcker

Western Blot Troubleshooting Western Blot Felsökning

Western Blot Books Western Blot Böcker

Western Blotting Protocol Western blotting protokoll

Western-blot protocol Western-blot protokoll

Preparation of Samples for SDS-PAGE Gel Electrophoresis from Prepared Cell Lysates Beredning av prover för SDS-PAGE gelelektrofores från Beredd Cell Lysates

1. Prepare gels for SDS-PAGE Förbered geler för SDS-PAGE
2. Prepare 1X running buffer Bered 1X kör buffert
3. Add 50 mL of beta-mercaptoethanol to 950 ml sample buffer (for 1 mL). Tillsätt 50 ml av β-merkaptoetanol till 950 ml prov buffert (1 ml). (only if you have not pre-added beta-mercaptoethanol to sample buffer) (endast om du inte redan lagt beta-merkaptoetanol att provet buffert)
4. Add sample buffer to each sample (pre-determine how much sample you can load per well - BioRad thin combs can retain about 30uL. Large combs can accomate up to 50uL). Lägg provet buffert till varje prov (förväg avgöra hur mycket exempel som du kan ladda per brunn - BioRad tunna kammar kan behålla om 30uL. Large kammar kan accomate upp till 50uL).
5. Vortex samples briefly. Vortex prover kort.
6. Poke a hole in cap of each tube (to prevent the tops popping when boiling) Peta ett hål i tak för varje provrör (för att förhindra toppar popping när kokande)
7. Boil in heating block/water bath at (95°C) for 5 minutes (lower temperatures have been shown to prevent non-specific protein aggregation) Koka i värmeblocket / vattenbad vid (95 ° C) i 5 minuter (lägre temperaturer har visat att förhindra icke-specifikt protein aggregation)

After Boiling Protein Samples - Loading and Running the SDS-PAGE Gel Efter Boiling Protein Prover - Lastning och köra SDS-PAGE Gel

1. Centrifuge samples for 1 minute at high speed. Centrifugera prover för 1 minut i hög hastighet.
2. Load sample into each lane. Load prov i varje lane.
3. Load MW (molecular weight ladder) reference. Load MW (molekylvikt stege) referens. (you may want (du kanske vill
4. Run gel at 100V (100V through stacking gel, voltage can be increased up to 200V when running in separating gel with plenty of running buffer) Kör gelen vid 100V (100V genom stapling gel, spänning kan ökas upp till 200V när man kör i separera gel med mycket kör buffert)

Transfer of Protein Samples to Membrane Överföring av Protein prover som Membrane

1. Prepare 1X Transfer buffer Bered 1X Transfer buffert
2. Soak and shake gel in Transfer buffer for 15 min Fukta och skaka gel i Transfer buffert för 15 min
3. Soak nitrocellulose membrane (or PVDF) and filter paper (extra thick) for several minutes. Fukta nitrocellulosa membran (eller PVDF) och filtrerpapper (extra tjock) i flera minuter.
4. Place sandwich on transfer cell: Plats smörgås om överföring cell:

Extra thick filter paper CLEAR Extra tjockt filtrerpapper CLEAR
Membrane
Gel
Extra thick filter paper BLACK Extra tjockt filtrerpapper BLACK

5. Electric transfer: 35V overnite or 90V for 1 hour depending on the size of your protein or your patience! Electric överföring: 35V overnite eller 90 V för 1 timme beroende på storleken på ditt protein eller ditt tålamod!

Western Blotting Protocol or Immunoblotting Western blotting protokoll eller immunoblotting

1. Prepare 1X TBST from stock solutions. Bered 1X TBST från stamlösningar.
2. Prepare blocking buffer (3% Bovine Serum Albumin or 5% Blotting-grade milk (Blotto) in TBST). Förbered blockerande buffert (3% bovint serumalbumin eller 5% blotting-grade mjölk (plakat) i TBST). (you may want to try several different blocking times and conditions). (du kanske vill prova flera olika blockera tider och villkor).
3. Wash membrane in 1X TBST with shaking for 10 min. Tvätta membranet i 1X TBST med skakning i 10 min.
4. Block at room temperature for 1 hour with blocking buffer (shaking or circular rotator) Block i rumstemperatur i 1 timme med blockerande buffert (skakning eller runda roterande)
5. Incubate your membrane (PVDF or nitrocellulose) with primary 1° Ab antibody overnight (for difficult blotting conditions ie phosphorylation of proteins) or 1 hour for ( easy conditions such as total protein) at 4°C (overnite) or room temperature (1 hour incubation only) covered with saran wrap (gentle shaking). Inkubera din membrane (PVDF eller nitrocellulosa) med primär 1 ° Ab antikropp övernattning (för svårt blotting villkor dvs fosforylering av proteiner) eller 1 timme för (lätt förhållanden såsom totala protein) vid 4 ° C (overnite) eller rumstemperatur (1 timme inkubation endast) täckt med Saran Wrap (varsam skakning). You can use plastic tubs from the dollar store for this (use these only for blotting!) or use pipette box bottoms. Du kan använda plast badkar från dollarn butik för detta (använda dessa bara för blotting!) Eller använd pipett rutan bottoms. The dilution for primary antibody is around 1:1000. Utspädning för primär antikropp är cirka 1:1000. See manufacturer's instructions. Se tillverkarens anvisningar.
6. Wash with 1X TBST  3 X 15 min Tvätta med 1X TBST 3 x 15 min
7. Incubate your membrane (PVDF or nitrocellulose) with secondary antibody, 2° Ab for 30 – 45 min or (1 hour - for difficult blotting conditions) at room temperature. Inkubera din membrane (PVDF eller nitrocellulosa) med sekundär antikropp, 2 ° AB för 30 - 45 min eller (1 timme - för svårt blotting villkor) vid rumstemperatur. The dilution for secondary antibodies is usually 1:10,000 or higher. Utspädning för sekundära antikroppar är vanligtvis 1:10000 eller högre. (ie 1uL of secondary in 10mL of TBST per membrane) See manufacturer's instructions.  You may want to add your antibody to blocking solution to decrease non-specific binding especially if you got high background in your first experiment. (dvs 1uL av sekundär i 10 ml av TBST per membran) Se tillverkarens anvisningar. Du kanske vill lägga din antikropp som blockerar lösningen att minska icke-specifik bindning speciellt om du fick hög bakgrund i det första experimentet.
8. Wash with TBST   4-5 X 10 min. Tvätta med TBST 4-5 x 10 min. This is the most important washing step. Detta är den viktigaste tvätt steg.
9. ECL (5min) ECL (5min)
10. Expose to film. Expose till film. Usually exposure time of western blots is about 10-30 seconds. Vanligtvis exponeringstid av Western blotting är ca 10-30 sekunder. Longer (5-10 minutes) for phosphorylation. Längre (5-10 minuter) för phosphorylation. If you have a really weak signal, either you need to load more protein or try to increase exposure time (up to 30 minutes - you can try leaving it in a casette longer). Om du har en riktigt svag signal, antingen du behöver läsa in mer protein eller försöka öka exponeringen tid (upp till 30 minuter - du kan försöka lämna den i en kassettbandspelare längre).
11. Keep your membrane! Håll dina membrane! You can keep your membrane in TBST 1X in the fridge for a while. Du kan hålla dina membranet i TBST 1X i kylskåpet en stund. You may need it for the following reasons: 1) checking loading (paper reviewers may ask for total protein or a loading standard such as actin). Du kanske behöver det av följande skäl: 1) kontroll lastning (papper recensioner kan begära totala protein eller en laddning standard som aktin). Also, you can probe initially for a phospho-protein and then strip and reprobe for total protein. Du kan också sond till en början för en phospho-protein och sedan band och reprobe för total protein.

Also see our Western Blotting Membrane Stripping Protocol Se även våra Western blotting Membrane Strippning protokoll