home > protein-microarrays > protein-chip-attachment > index.php hem> protein-mikroarrayer> protein-chip-kvarstad> index.php
 |
|---|
 |  |  |  |  |  |
|---|---|---|---|---|---|
Protein Array Protocols Protein Array protokoll | Protein Array Bioinformatics Protein Array Bioinformatik | Learn about Protein Arrays Läs om Protein Arrays | Protein Array Kits and Products Protein Array Kits och Produkter | Protein Array Forum Protein Array Forum | Proteomic News Proteomic Nyheter |
Protein and Antibody Microarrays Protein och Antibody Microarrays
Attachment Attachment
To attach proteins to a solid surface, the surface of the substrate has to be modified to achieve maximum binding capacity (8,27). The proteins are attached to the chip on a protein attachment layer (see Figure 3). This layer is typically an organic film which varies with the nature of the application. A variety of materials have been studied including agarose (39), dextran-based hydrogel (40), porous polyacrylamide hydrogel hydrophilic polymers and polyamino acids (41). Att bifoga proteiner till en fast yta, yta substrat måste ändras för att uppnå maximal bindande kapacitet (8,27). Proteiner som är knutna till de marker på ett protein kvarstad skikt (se figur 3). Detta lager är vanligen en organisk film som varierar med vilken typ av ansökan. En mängd olika material har studerats inklusive agaros (39), dextran-baserade hydrogel (40), porösa polyakrylamid hydrogel hydrofila polymerer och polyamino syror (41).
A convenient attachment method used nitrocellulose-membrane or poly-L-Lysine coated glass such that proteins could be passively absorbed onto the surface through non-specific interactions (34,42,43). The attached proteins bind onto the surface in random orientations and can be washed off under stringent washing conditions. However, the noise level is usually higher because of the non-specific absorption/adsorption. En bekväm fastsättning metod som används nitrocellulosa-membran eller poly-L-Lysine belagda glas så att proteiner kan vara passivt absorberas på ytan genom icke-specifika interaktioner (34,42,43). Bifogade binder på ytan i slumpmässig riktlinjer och kan tvättas bort enligt strikta tvätt villkor. Men ljudnivån är oftast högre på grund av icke-specifik absorption / adsorption.
A more specific and stronger attachment is achieved by creating reactive surfaces on glass that can covalently cross-link to proteins (31,36,26). A bifunctional silane cross-linker is used to form a self-assembled monolayer (SAM), which has one functional group that reacts with the hydroxyl groups on glass the glass surface, and another group which is free to react with primary amine groups of proteins or can be further chemically modified to reach maximum specificity (44,45). Another variation is gold-coated glass (46,47). The advantage of gold-coated chips is that SPR and mass spectrometry can be integrated as detection methods to monitor the dynamics of the reaction, and to identify the captured molecules. En mer specifik och starkare kvarstad uppnås genom att skapa reaktiva ytor i glas som kan kovalent över länkar till proteiner (31,36,26). Bifunctional silan cross-linker används för att bilda en self-assembled monolayer (SAM), vilket har en funktionell grupp som reagerar med hydroxylgrupper i glas till glasytan, och en annan grupp som är fri att reagera med primär amin grupper av proteiner eller kan ytterligare kemiskt modifierade för att nå maximal specificitet (44,45). En annan variant är guld - belagda glas (46,47). Fördelen med guld-coated chips är att SPR och masspektrometri kan integreras som detektionsmetoder för att övervaka hur snabbt och i vilken reaktion, och att identifiera de tillfångatagna molekyler.
The above-mentioned covalent cross-linking approaches however have a disadvantage. De ovan nämnda kovalenta tvärbindningsmedel tillvägagångssätt dock har en nackdel. Due to the fact that reactive ligands also exist in the side chains of proteins it is possible that their random attachment may alter the native confirmation of proteins, reduce the activity of proteins, or make them inaccessible to probes (8,27). På grund av att reaktiva ligands finns även inom den sida kedjor av proteiner är det möjligt att deras slumpmässiga kvarstad får ändra de infödda bekräftelse av proteiner, minskning av verksamheten inom proteiner, eller göra dem otillgängliga för sonder (8,27).
In order to orient proteins uniformily away from the surface of the chip, proteins may be fused with a high-affinity tag at their amino or carboxy termini. With this method, immobilized proteins/antibodies are more likely to remain in their native conformation, thus allowing the analytes efficient access to the active sites of the proteins. This method was first successfully demonstrated with the attachment of 5800 fusion proteins containing a His tag onto a nickel-coated glass slide (26). Other affinity methods such as glutathione/GST have also been used (48). För att orientera proteiner uniformily bort från ytan av chipet, proteiner kan vara smält med en high-affinity tag i deras amino eller karboxi ändstationer. Med denna metod, immobilized proteiner / antikroppar är mer benägna att stanna kvar på sitt konformation, vilket låta analyter effektiv tillgång till den aktiva webbplatser av proteiner. Denna metod var första demonstrerades framgångsrikt med kvarstad på 5800 fusion proteiner som innehåller en Hans tag på en nickel-belagda glas slide (26). Andra affinitet metoder såsom glutation / GST har även använts (48).
Streptavidin based immobilization methods have been also widely employed to attach any biotinylated biological element to the array surface (49). Streptavidin bygger immobilization metoder har också i stor utsträckning används för att fästa någon biotinylerade biologiska element i samlingen yta (49).
The chip support material is important because proteins are highly sensitive to physiochemical properties. For example, polar arrays are chemically treated to bind to hydrophilic proteins however such surfaces are unsuitable for cell membrane proteins (eg G-protein coupled receptors) as they possess hydrophobic domains (9). The chip stöd material är viktigt eftersom proteiner är mycket känsliga för physiochemical properties. Exempelvis polar matriserna är kemiskt behandlade för att binda till hydrofila proteiner emellertid sådana ytor är olämpliga för cell membrane protein (t.ex. G-proteinkopplade receptorer) som de har hydrofoba domäner (9).
Proteins do not behave like nucleic acids, and different proteins will behave in different ways when exposed to the same surface chemistry. Different types a surface chemistries will thus promote the retention of some proteins and cause denaturation or loss of activity of others. Therefore, the proper choice of surface chemistry is important as this will allow immobilized proteins of diverse types to retain their secondary and tertiary structures, and thus their biological activity. This problem is magnified when the number of different spots on the chip increases, as there may be 100 different ways to immobilize 100 different proteins in order to obtain proper folding and function of all the proteins. Also a significant problem is because the functions of most proteins are currently unknown, so there is no method to actually test whether they are still functional on the chip (7). Proteiner inte bete sig som nukleinsyror, och olika proteiner kommer att uppträda på olika sätt när de utsätts för samma ytkemi. Olika typer en yta chemistries kommer således att främja bevarandet av vissa proteiner och orsaka denaturering eller förlust av aktivitet av andra. Därför kan korrekt val av ytkemi är viktigt, eftersom detta gör immobilized proteiner av olika typer behålla sina sekundära och tertiära strukturer, och därmed deras biologiska aktivitet. Problemet förstoras när antalet olika fläckar på chipet ökar, eftersom det kan finnas 100 olika sätt att göra orörlig 100 olika proteiner för att få korrekt veckning och funktion av alla proteiner. också en betydande problem är att arbetsuppgifterna för de flesta proteiner är för närvarande okänt, så det finns ingen metod att verkligen testa om de fortfarande är funktionella om chip (7).
Next: Protein Chip Delivery Methods Nästa: Protein Chip leveransmetoder
References for Protein and Antibody Microarrays Hänvisningar till protein och Antibody Microarrays
Back to: Tillbaka till:
Introduction and Background to Protein Chips and Antibody Chips. Inledning och bakgrund till Protein chips och Antibody Chips.
Types of Antibody and Protein Chips Typer av antikroppar och Protein Marker
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Disclaimer / Terms of Service | Privacy policy | © 2005-2007 Molecular Station.com, Alla rättigheter reserverade.
Send this page to a friend Skicka denna sida till en vän
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
