home > pcr > history-of-pcr > index.php hem> PCR> history-of-PCR> index.php
 |
|---|
 |  |  |  |  | |
|---|---|---|---|---|---|
PCR Protocols PCR-protokollen | PCR Bioinformatics and Databases PCR bioinformatik och databaser | Learn about PCR Läs mer om PCR | PCR Kits and Products PCR Kits och Produkter | PCR Forum PCR Forum | PCR Books PCR Böcker |
Also visit PCR Station Besök även PCR Station
Copyright 2006 MolecularStation Copyright 2006 MolecularStation
Polymerase Chain Reaction - PCR Polymerase Chain Reaction - PCR
Table of Contents : Innehåll:
Introduction to PCR - Polymerase Chain Reaction Introduktion till PCR - Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymeraskedjereaktion (PCR)
PCR, a Concept to be Discovered PCR, ett begrepp att bli upptäckt
General Principles of the PCR General Principles av PCR
Polymerases/Reaction Specificity and Efficiency Polymeraser / specificiteten och Effektivitet
PCR and Molecular Cloning PCR och molekylär Kloning
Misincorporation: Errors of In Vitro Systems Misincorporation: Fel av in vitro-Systems
Reaction Specificity Specificiteten
Major Advantages of PCR as a Cloning Method include its Rapidity, Sensitivity, and Robustness Fördelarna med PCR som en Kloning Metod ta med sin snabbhet, lyhördhet, och robusthet
Limitations of PCR Begränsningar av PCR
Instruments for PCR Instrument för PCR
Oligonucleotide Synthesis Oligonucleotide Synthesis
Will PCR ever be replaced? Kommer PCR någonsin att ersättas? – Helicase-dependent Amplification (HDA) -- Helicase beroende Amplification (HDA)
More than 30 years ago, the introduction of recombinant DNA technology as a tool for the biological sciences revolutionized the study of life. Molecular cloning allowed the study of individual genes of living organisms; however this technique was dependent on obtaining a relatively large quantity of pure DNA. This depended on the replication of the DNA of plasmids or other vectors during cell division of microorganisms (1). Researchers found it extremely laborious and difficult to obtain a specific DNA in quantity from the mass of genes present in a biological sample (2). Recombinant DNA technology made possible the first molecular analysis and prenatal diagnosis of several human diseases. Fetal DNA obtained by amniocentesis sampling could be analyzed by restriction enzyme digestion, electrophoresis, southern transfer and hybridization to a cloned gene or oligonucleotide probes (3). However, southern blotting permitted only rudimentary mapping of genes in unrelated individuals (4). Mer än 30 år sedan införandet av rekombinant DNA-teknik som ett verktyg för de biologiska vetenskaperna revolutionerat studiet av livet. Molekylär kloning tillåtet studier av enskilda gener i levande organismer, men denna teknik var beroende av att få en relativt stor mängd ren DNA. Detta berodde på replikering av DNA i plasmider eller andra vektorer under celldelningen av mikroorganismer (1). Forskare fann det oerhört mödosamt och svårt att få en viss DNA i mängd från massan av gener som finns i ett biologiskt prov (2 ). Rekombinant DNA-teknik möjliggörs första molekylär analys och fosterdiagnostik av flera mänskliga sjukdomar. Fetal DNA erhålls genom Amniocentesis provtagning skulle kunna analyseras av restriktionsenzym matsmältning, elektrofores, södra och hybridisering till ett klonat genen eller oligonukleotidprober (3). Men södra blotting tillåtas endast rudimentär kartläggning av gener i samband individer (4).
PCR, an acronym for Polymerase Chain Reaction (5,6), allowed the production of large quantities of a specific DNA from a complex DNA template in a simple enzymatic reaction. PCR is a recently developed procedure for the in vitro amplification of DNA. PCR has transformed the way that almost all studies requiring the manipulation of DNA fragments may be performed as a results of its simplicity and usefulness (7). PCR, en akronym för Polymerase Chain Reaction (5,6), tillåts framställning av stora mängder av en specifik DNA från en komplex DNA-mall på ett enkelt enzymatisk reaktion. PCR är ett nyligen utvecklat förfarande för in vitro-amplifiering av DNA. PCR har förändrat sättet att nästan alla studier som kräver manipulation av DNA-fragment kan utföras som ett resultat av dess enkelhet och användbarhet (7).
In the 1980s, Kary Mullis (Figure 1) and a team of researchers at Cetus Corporation at Cetus Corporation conceived of a way to start and stop a polymerase's action at specific points along a single strand of DNA. Mullis also realized that by harnessing this component of molecular reproduction technology, the target DNA could be exponentially amplified. This DNA amplification procedure was based on an in vitro rather than an in vivo process (5,6,8). Cell-free DNA amplification by PCR was able to simplify many of the standard procedures for cloning, analyzing, and modifying nucleic acids (1). Previous techniques for isolating a specific piece of DNA relied on gene cloning – a tedious and slow procedure. PCR, on the other hand Kerry Mullis stated “lets you pick the piece of DNA you’re interested in and have as much of it as you want” (2,8). På 1980-talet Kary Mullis (Figur 1) och ett team av forskare vid Cetus Corporation i Cetus Corporation utformades av ett sätt att starta och stoppa en polymerashämmare: s åtgärder på specifika punkter längs en del av DNA. Mullis också insett att genom att utnyttja denna komponent molekylär reproduktion teknik, mål-DNA kan vara exponentiellt förstärks. DNA-amplifiering förfarandet grundade sig på en in vitro stället för en in vivo-processen (5,6,8). Cell-free DNA-amplifiering med PCR kunde förenkla många av den standardiserade förfaranden för kloning, analysera och ändra nukleinsyror (1). Föregående tekniker för att isolera en specifik del av DNA åberopas gen kloning - en tråkig och långsam. PCR, å andra sidan Kerry Mullis uppgav "låter dig välja bit DNA som du är intresserad av och ha så mycket du vill "(2,8). When other Cetus scientists eventually succeeded in making the polymerase chain reaction perform as desired in a reliable fashion, they had an immensely powerful technique for providing essentially unlimited quantities of the precise genetic material molecular biologists and others required for their work (8). Since the first report in1985, more than 5000 scientific papers were published by 1992 (1). Furthermore, the large number of publications of course makes it impossible to review all the important contributions to the development and application of PCR technology; however we will attempt to review here the most important developments in the practice of basic PCR. När andra Cetus forskarna slutligen lyckats göra polymerase chain reaction fungera som önskas på ett tillförlitligt sätt, de hade en oerhört kraftfull teknik för att tillhandahålla huvudsak obegränsade mängder av exakta genetiska material molekylär biologer och annat som krävs för deras arbete (8). Eftersom första rapporten in1985, mer än 5000 vetenskapliga artiklar publicerades av 1992 (1). Dessutom är det stora antalet publikationer som givetvis gör det omöjligt att granska alla viktiga bidrag till utveckling och tillämpning av PCR-tekniken, men vi kommer att försöka granska här den viktigaste utvecklingen i praktiken av grundläggande PCR.
PCR was thought to be conceived by Dr. Kerry Mullis in 1983 while working at the Cetus Corporation in Emeryville, CA. However, some pioneering work was also done by Gobind Khorana in 1971 who described a basic principle of replicating a piece of DNA using two primers. Progress then was limited by primer synthesis and polymerase purification issues (9). In Mullis’s head, the invention grew from a theoretical scheme to perform limited dideoxynucleotide sequencing of unique human genes using synthetic oligonucleotides for the purpose of diagnosing common human disease mutations. An obvious obstacle to such a direct sequencing strategy was the high complexity of the human genome (3.3 X 109 base pairs). Thus, a second oligonucleotide or primer was added to block the progression of the synthesis of the first primer. Later however, this second primer was included to bind to the other DNA strand, so that each strand of the mutant allele would contribute to the eventual signal. If the scheme involving simultaneous hybridization of primers to each strand was modified by heating the mixture and then repeating the annealing and extension steps, then the primary signal would be increased even further. Repeating the steps would enable the products of the first round to be duplicated in the second cycle, to yield two copies. Repeating the cycle again would result in four copies, et cetera . Several weeks passed before this great idea was attempted (8). Two primers were synthesized to be perfectly complementary to each end of the 110 base pair region of a cloned segment of the human b-globin gene, the amplification was performed, and the products were identified by acrylamide gel electrophoresis. The end result was the anticipated 110 base pair DNA fragment and the beginning of PCR as a basic technique in molecular biology (5,6). PCR ansågs vara utformad av Dr Kerry Mullis under 1983 samtidigt som arbetar på Cetus Corporation i Emeryville, Kalifornien. Vissa banbrytande arbete har också utförts av Gobind Khorana år 1971 som beskrev en grundläggande princip för kopierar en bit DNA som använder två grundfärg. Framsteg sedan var begränsat av primer syntes och polymeras rening frågor (9). Mullis huvud, uppfinningen växte från ett teoretiskt system för att utföra begränsade dideoxynucleotide sekvensering av unika mänskliga gener med hjälp av syntetiska oligonucleotides för att diagnostisera vanliga sjukdomar hos människan mutationer. Ett uppenbart hinder för en sådan direkt sekvensering strategi var den höga komplexiteten i det mänskliga genomet (3,3 X 109 baspar). därmed en andra oligonucleotide eller primer lades till att blockera utvecklingen i syntesen av de första primer. Later dock Denna andra primer ingick att binda till den andra DNA strand, så att varje del av den muterade allelen skulle bidra till en eventuell signal. Om det system som innebär samtidig hybridisering mellan primrar att varje del har ändrats genom upphettning av blandningen och sedan upprepa annealing och utbyggnad steg, då det primära signal skulle ökas ytterligare. upprepa stegen skulle göra det möjligt för produkter av den första omgången som skall kopieras i den andra cykeln, att ge två kopior. upprepa cykeln igen skulle resultera i fyra exemplar, et cetera. Flera veckor innan denna stora idé har försökt (8). Två första var syntetiserade vara perfekt komplement till varje ände av 110 bas par region i ett klonat segment av mänskliga b-globingenen, amplifiering utfördes, och de produkter som togs fram av akrylamid gelelektrofores. Slutresultatet var den förväntade 110 base pair DNA-fragment och början av PCR som en grundläggande teknik i molekylärbiologi (5,6).
In Mullis's original PCR process(5,6,8), the enzyme was used in vitro (in a controlled environment outside an organism). I Mullis ursprungliga PCR-processen (5,6,8), det enzym användes in vitro (i en kontrollerad miljö utanför en organism). The double-stranded DNA was separated into two single strands by heating it to 96°C. Den dubbla DNA var uppdelat i två delar genom att värma den till 96 ° C. At this temperature, however, the E.Coli DNA polymerase was destroyed so that the enzyme had to be replenished after the heating stage of each cycle. Vid denna temperatur, men de E. coli DNA-polymeras förstördes så att enzymet måste fyllas på efter uppvärmning skede av varje cykel. Mullis's original PCR process was very inefficient since it required a great deal of time, vast amounts of DNA-Polymerase, and continual attention throughout the PCR process. Mullis ursprungliga PCR-processen var mycket ineffektivt, eftersom det krävs mycket tid, stora mängder av DNA-polymeras och ständig uppmärksamhet i hela PCR-processen.
Examination of the PCR amplification mechanism reveal its simplicity but also its elegance (Figure 2). Oligonucleotide primers are first designed to be complementary to the ends of the sequence to be amplified, and then mixed in molar excess with the DNA template and deoxyribonucleotides in an appropriate buffer. Following heating to denature the original strands and cooling to promote primer annealing, the oligonucleotides each bind to a different strand of the target fragment. The primers are positioned so that when each is extended by the action of a DNA polymerase, the newly synthesized strands will overlap the binding site of the opposite oligonucleotide. As the process of denaturation, annealing, and polymerase extension is continued the primers repeatedly bind to both the original DNA template and complementary sites in the newly synthesized strands and are extended to produce new copies of DNA (Figure 3). The end result is an exponential increase in the total number of DNA fragments that include the sequences between the PCR primers, which are finally represented at a theoretical abundance of 2n, where n is the number of cycles (1,7,13). Prövning av PCR-amplifiering mekanism avslöja sin enkelhet men också dess elegans (Figur 2). Oligonukleotidprimers först avsedd att vara ett komplement till ändarna av den sekvens som skall kompletteras och sedan blandas i molar överskott med DNA-mallen och deoxyribonucleotides i en lämplig buffert. Efter uppvärmning att denaturera de ursprungliga delarna och kylning att främja primer annealing, oligonucleotides varje binder till en annan del av målet fragment. grundfärg är placerade så att när varje förlängs med hjälp av DNA-polymeras, den nyligen syntetiserade delarna kommer att överlappa bindning av motsatt oligonucleotide. processen för denaturering, annealing och polymeras förlängning är fortsatt det första upprepade binda till både den ursprungliga DNA-mallen och kompletterande platser i nytillverkade programdelar och även kommer att producera nya exemplar DNA (Figur 3). Slutresultatet är en exponentiell ökning av antalet DNA-fragment som innehåller sekvenser mellan PCR-primers, som äntligen representerade på ett teoretiskt överflöd av 2n, där n är antalet cykler (1 , 7,13).
A DNA polymerase is a naturally occurring enzyme, a biological macromolecule that catalyzes the formation and repair of DNA. En DNA-polymeras är ett naturligt förekommande enzym, en biologisk makromolekyl som catalyzes bildning och reparation av DNA. It works by binding to a single DNA strand and creating a complementary strand. Det verkar genom att binda till en enda DNA strand och skapa en kompletterande del. The accurate replication of all living matter depends on this activity, where it functions to duplicate DNA when cells divide (10,11). Only recently have scientists learned to manipulate this activity and apply it to scientific research. The earliest PCR experiments utlilized the Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I at a temperature of 37C to amplify specific targets from human genomic DNA (5,6). Often these PCR reactions produced incompletely pure target product as judged by gel electrophoresis (1). These initial PCR amplifications with the Klenow fragment were not highly specific (5,6). Although a unique DNA fragment could be amplified ~200,000 fold from genomic DNA, only about 1% of the PCR product was the targeted sequence (13). A specific hybridization probe was required to analyse the amplified DNA (5,6). Den exakta replikering av alla levande material är beroende av denna verksamhet, där det fungerar att kopiera DNA när celler divide (10,11). Nyligen har forskare lärt sig att manipulera denna verksamhet och den tillämpas för vetenskaplig forskning. Tidigaste PCR experiment utlilized den Klenow fragment av Escherichia coli DNA-polymeras jag vid en temperatur på 37c att komplettera specifika mål från mänskliga arvsmassans DNA (5,6). Ofta är dessa PCR reaktioner produceras ofullständigt ren målet produkt som bedöms med gelelektrofores (1). Dessa inledande PCR amplifications med Klenow fragment var inte mycket specifika (5,6). Trots en unik DNA-fragment kan kompletteras ~ 200000 fold från genomiskt DNA, bara ca 1% av PCR-produkten var riktad sekvens (13). En särskild hybridization probe var skyldig att analysera DNA (5,6).
Some PCR conditions were determined to increase the stringency of primer hybridization such as lower MgCl2 concentrations and higher annealing temperatures. Några PCR villkor var fast beslutna att öka stränga primer hybridisering som lägre Mg Cl2 koncentrationer och högre annealing temperaturer.
Furthermore, the concentration of enzyme and primers, the annealing time, extension time, and number of PCR cycles all were found to effect the specificity of the PCR. Dessutom är den koncentration av enzym och grundfärg, annealing tid, förlängning tid, och antalet PCR-cykler alla befanns effekt det specifika i den PCR.
Also, the concentration of a specific sequence in a sample can also influence the relative homogeneity of the PCR products (1,7,13,14,15). Deoxyribonucleotide triphosphates and magnesium in an appropriate buffer are also important ingredients for PCR. The efficiency and specificity of PCRs can be affected by variations in the concentration and ratio of free magnesium, deoxyribonucleotide triphosphates, and primers. Även koncentrationen av en specifik sekvens i ett prov kan också påverka den relativa homogenitet av PCR-produkter (1,7,13,14,15). Deoxyribonucleotide trifosfater och magnesium i en buffert är också viktiga ingredienser för PCR. Verkningsgraden och specificitet PCRs kan påverkas av variationer i koncentrationen och förhållandet fria magnesium, deoxyribonucleotide trifosfater och grundfärg. These reagents must be optimized in order to achieve high specificity and yield (14). It was also discovered that the effect of temperature and oligonucleotide primer length on the specificity and efficiency of amplification by the polymerase chain reaction (15). Dessa reagenser skall vara optimerade för att uppnå hög specificitet och avkastningen (14). Det var också upptäckt att effekten av temperatur och oligonucleotide primer längd på specificitet och effektivitet amplifiering av polymerase chain reaction (15).
The inactivation of the Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I at the high temperature required for strand separation required the addition of enzyme after the denaturation step of each cycle (5,6). Prior to 1988, anyone conducting a PCR reaction procedure was obliged to sit patiently by a series of water baths or heating blocks and add a fresh aliquot of E.Coli DNA polymerase after each denaturation step, which was typically carried out by immersing the reaction vessel in boiling water for ½ a minute to 3 minutes (7). This rather tedious step was eliminated by the introduction of a thermostable DNA polymerase, the Taq DNA polymerase (12) once, at the beginning of the PCR reaction. The thermostable properties of the DNA polymerase activity were isolated from Thermus aquaticus (Taq) (Figure 4) that grow in geysers of over 110C, and have contributed greatly to the yield, specificity, automation, and utility of the polymerase chain reaction (1,7,12). The Taq enzyme can withstand repeated heating to 94C and so each time the mixture is cooled to allow the oligonucleotide primers to bind the catalyst for the extension is already present (1,7). However, higher annealing temperatures were not established until the single “most important development of PCR development” (8), the purification and commercial distribution of a heat-resistant DNA polymerase from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus ( Taq ) (12). Inaktivering av de Klenow fragment av Escherichia coli DNA-polymeras jag vid hög temperatur som krävs för område separation krävs tillsats av enzymet efter denaturering steg i varje cykel (5,6). Före 1988, vem som helst genomföra en PCR-reaktion som var skyldig att sitta tålmodigt genom en serie av vatten bad eller uppvärmning block och lägga en ny delmängd av E. coli DNA-polymeras efter varje denaturering steg, som normalt utförs av uppslukande reaktionen fartyget i kokande vatten under en halv minut till 3 minuter (7 ). Denna ganska tråkig steg var undanröjas genom införandet av en thermostable DNA-polymeras, Taq DNA-polymeras (12) en gång, i början av PCR-reaktionen. Thermostable egenskaper hos DNA-polymeras verksamhet har varit isolerade från Thermus aquaticus (Taq) (Figur 4) att växa i geysrar på över 110c, och har bidragit mycket till avkastning, specificitet, automatisering, och nyttan av polymerase chain reaction (1,7,12). Taq enzym kan motstå upprepad uppvärmning till 94c och så varje gång blandningen kyls att tillåta oligonukleotidprimers bindande katalysator för utbyggnad redan finns (1,7). dock högre annealing temperaturer var inte fastställas förrän den enda "viktigaste utvecklingen av PCR utveckling" (8), rening och kommersiell distribution av en värmetålig DNA-polymeras från termofila bakterien Thermus aquaticus (Taq) (12).
The isolation of a heat-resistant DNA polymerase also allowed primer annealing and extension to be carried out at elevated temperatures (1,7,12,13), thereby reducing mismatched annealing to nontarget sequences (non-specific amplification) or increasing specificity. In this way, for many amplifications the PCR product could be detected as a single ethidium bromide-stained band on an electrophoretic gel (12). This increased specificity also increased DNA yield of the target sequence. Moreover, longer PCR products could be amplified from genomic DNA, probably due to a reduction in the secondary structure of the template strands at the elevated temperature used for primer extension. The upper size limit for Klenow fragment polymerase amplification was only about 400bp. Taq polymerase and other thermostable polymerases have synthesized fragments up to 10 kb (1,7,12,13). The availability of Taq polymerase has also greatly simplified the automation of the reaction as it is a much easier task to construct an apparatus that will cycle a reaction tube through different temperatures than to manufacture a device that would perform both the thermocycling and the addition of enzyme aliquots. Currently there is a great variety of thermocyclers available commercially. This development has been a significant factor in the rapid application of this technology by the scientific community (7). Isoleringen av en värmetålig DNA-polymeras också tillåtet primer annealing och utbyggnad som skall genomföras vid förhöjda temperaturer (1,7,12,13) och därmed minska missmatchad annealing att nontarget sekvenser (icke-specifika PCR) eller öka specificitet. detta sätt, för många amplifications PCR-produkt kan uppdagas som en enda etidiumbromid-färgade band på elektrofores gel (12). Denna ökade specificiteten också ökat DNA avkastningen av det mål sekvens. Dessutom längre PCR-produkter skulle kunna kompletteras av arvsmassans DNA, förmodligen på grund av en minskning av de sekundära struktur mallen delarna vid förhöjd temperatur används för primer förlängning. Den övre storleksgräns för Klenow fragment polymeras amplifiering var bara cirka 400bp. Taq polymerase och andra thermostable polymeraser har syntetiserade fragment upp till 10 kb (1,7,12,13). Tillgängligheten av Taq-polymeras har också kraftigt förenklat automatiseringen av de reaktioner som det är en mycket enklare uppgift att konstruera en apparat som kommer att cykla en reaktion röret genom olika temperaturer än att tillverka en enhet som skulle utföra både thermocycling och tillsats av enzym alikvoter. närvarande finns ett stort urval av thermocyclers kommersiellt tillgängliga. Denna utveckling har varit en betydelsefull faktor för ett snabbt införande av denna teknik från forskarvärlden (7).
In addition to the production of double-stranded, blunt-ended DNA fragments which may be formed by PCR, two other features of the PCR scheme contribute greatly to the utility of PCR. First, the position of binding of the primers defines the boundaries of the amplified fragment and therefore the prior molecular cloning requirement of restriction endonuclease recognition sites is not required for PCR. As only a limited number of DNA sequences are restriction sites, PCR greatly increases the flexibility of choice of fragment size and composition. Secondly, it is not necessary for PCR oligonucleotides to be exactly complementary to the template DNA. “Tails” may be added to the 5’ end of the primer to introduce sequences within the priming sites which thus may be exploited to introduce restriction endonuclease recognition sites or other useful sequences such as mutations into the amplified DNA. This phenomena allowed the emergence of PCR as a method for rapid DNA cloning (1,7,13). Förutom produktion av dubbel-strandsatta, trubbig fattning DNA-fragment som kan bildas av PCR, två andra detaljer av PCR-system bidra till att nyttan av PCR. Först den ståndpunkt som bindande i första definierar gränserna för det förstärkta fragmentet och därför före molekylär kloning krav på begränsning endonuclease erkännande platser krävs inte för PCR. Eftersom endast ett begränsat antal DNA-sekvenser är begränsning webbplatser, PCR ökar flexibiliteten i valet av fragment storlek och sammansättning. det andra är det inte nödvändigt för PCR oligonucleotides att vara exakt kompletterar mallen DNA. "Tails" får läggas till den 5 'slutet av primer att införa sekvenser inom priming webbplatser som därmed kan utnyttjas för att införa restriktioner endonuclease erkännande webbplatser eller annan användbar sekvenser exempelvis mutationer i DNA. Detta fenomen banat väg för PCR som en metod för snabba DNA kloning (1,7,13).
Molecular cloning has benefited from the emergence of PCR as a technique. Direct cloning was first conducted using a 110 bp DNA fragment amplified by PCR and oligonucleotide primers which contained restriction endonuclease recognition sites added to their 5’ ends. These sites were used to facilitate cloning of the amplified DNA into an M13 plasmid (17). The 110 bp fragment was also sequenced to confirm that this approach was a rapid yet reliable approach to cloning. (Figure 5) Molekylär kloning har gynnats av framväxten av PCR som en teknik. Direct kloning först genomföras med ett 110 bp DNA-fragment förstärks av PCR och oligonukleotidprimers som innehöll begränsning endonuclease erkännande webbplatser läggas till deras 5 "slutar. Dessa webbplatser har använts för att underlätta kloning av DNA i en M13 plasmid (17). 110 bp-fragmentet var också ordnat att bekräfta att detta var en snabb ändå tillförlitlig metod för kloning. (Figur 5)
Cell-based DNA cloning involves DNA replication in vivo, which is associated with a very high fidelity of copying because of proofreading mechanisms. However, when DNA is replicated in vitro as with PCR, the copying error rate is considerably greater. The most widely used polymerase, Taq DNA polymerase however, has no associated 3’to 5’ exonuclease to confer a proofreading function. Thus the error rate due to base misincorporation during DNA replication is rather high for Taq : for a 1 kb sequence that has undergone 20 effective cycles of duplication, approximately 40% of the new DNA strands synthesized by PCR using this enzyme will contain an incorrect nucleotide resulting from a copying error (16). Cell-baserad DNA kloning innebär DNA replication in vivo, vilket är förenat med en mycket hög fidelity av kopiering på grund av korrekturläsning mekanismer. Men när DNA kopieras in vitro som med PCR, kopiering fel är betydligt större. Den mest använda polymeras, Taq DNA-polymeras dock inte har några associerade 3'to 5 "exonuclease att ge en korrekturläsning funktion. Således felprocenten på grund att basera misincorporation under DNA replikation är ganska högt för Taq: För en 1 kb sekvens som har genomgått 20 effektiva kretslopp av dubbelarbete, ca 40% av den nya DNA-strängar syntetiserade av PCR med hjälp av detta enzym kommer att innehålla en felaktig nukleotid följd av en kopiering fel (16). Therefore, even if the PCR reaction involves amplification of a single DNA sequence, the final product will be a mixture of almost matching, but not identical DNA sequences. Despite the errors due to replication in vitro , DNA sequencing of the total PCR product may give the correct sequence due to the fact that the incorporation of incorrect bases is essentially random and the contribution of one incorrect base on one or more strands is overwhelmed by the contributions from the huge majority of strands which will have the correct sequence. However, if the PCR product is to be cloned in cells, several individual clones may need to be sequenced in order to determine the correct (consensus) sequence, prior to conducting further experiments. Därför, även om PCR-reaktionen innebär amplifiering av en gemensam DNA-sekvens, slutprodukten kommer att vara en blandning av nästan matchning, men inte identiska DNA-sekvenser. Trots de fel som beror på replikation in vitro, DNA-sekvensering av hela PCR-produkten kan ge rätt sekvens beror på att införlivandet av felaktiga grunder är i grunden slumpmässig och bidrag av en felaktig bas i ett eller flera delområden är överväldigad av bidrag från den stora majoriteten av delar som har rätt ordningsföljd. Men om PCR-produkten skall klonas i celler, flera enskilda kloner kan behöva planeras för att fastställa den korrekta (konsensus) sekvens, före utföra ytterligare experiment.
More recently, the problem of infidelity of DNA replication during the PCR reaction has been considerably reduced by using alternative heat-stable DNA polymerases which have associated 3’ to 5’ exonuclease activity. Pyrococcus furiosus ( Pfu ) DNA polymerases and Thermococcus Litoralis (VENT) are becoming more widely used because of the proofreading conferred by their associated 3’ to 5’ exonuclease activity (18). The resulting PCR product of Pfu for example, has a much lower level of mutations introduced by copying errors: for a 1 kb segment of DNA that has undergone 20 effective cycles of duplication, about 3.5% of the DNA strands in the product carry an altered base (16). På senare tid har problemet med otrohet av DNA-replikation under PCR-reaktionen har varit avsevärt minskas med hjälp av alternativa värme-stabil DNA-polymeraser som har associerade 3 "5" exonuclease verksamhet. Pyrococcus furiosus (PFU) DNA-polymeraser och Thermococcus litoralis (VENT) blir allt större utsträckning på grund av den korrekturläsning som följer av deras associerade 3 "5" exonuclease aktivitet (18). följd PCR-produkten av PFU till exempel, har en mycket lägre nivå av mutationer som infördes genom kopiering fel: för en 1 kb segment av DNA som har genomgått 20 effektiva kretslopp av dubbelarbete, ca 3,5% av DNA-strängar i produkten medföra en förändrad bas (16).
New approaches to improve specificity have been developed based on the recognition that the Taq DNA polymerase retains considerable enzymatic activity at temperatures well below the optimum for DNA synthesis. Thus, primers annealing non-specifically to a partially single stranded template region can be extended before the reaction reaches 72°C for extension of specifically annealed primers. If the DNA polymerase is activated only after the reaction has reached high (>70°C) temperatures, non-target amplification can be minimized (19,20). This “Hot start” approach can be accomplished by manual addition of an essential reagent to the selection tube at elevated temperatures. The addition of ssDNA binding protein has also been reported to increase specific amplification. A more user friendly approach is to use either inhibition or inactivation of the DNA polymerase itself. Nya metoder för att förbättra specificitet har utvecklats bygger på insikten att det Taq DNA-polymeras behåller stora enzymatisk aktivitet vid temperaturer långt under det optimala för DNA-syntesen. Alltså, första annealing icke specifikt till en delvis enkelsträngade mall region kan förlängas innan reaktion når 72 ° C för utbyggnad av särskilt släckglödgat grundfärg. Om DNA-polymeras aktiveras först efter reaktionen har nått hög (> 70 ° C) temperaturer, utanför målgruppen amplifiering kan minimeras (19,20). "Hot start "Tillvägagångssätt kan åstadkommas genom manuell tillsättning av ett viktigt reagens till valet röret vid förhöjda temperaturer. Tillägget av ssDNA binding protein har också rapporterats att öka specifika PCR. En mer användarvänlig metod är att använda antingen hämning eller inaktivering av DNA polymeras själv. Two types of inhibition of Taq DNA polymerase have been tried including oligonucleotide inhibition (21) and antibody (22) inhibition. Två typer av hämning av Taq DNA-polymeras har försökt inklusive oligonucleotide inhibition (21) och antikroppar (22) inhibition. Highly specific oligonucleotide inhibitors of both Taq DNA polymerases have been produced. Mycket specifika oligonucleotide hämmare av både Taq DNA-polymeraser har producerats. These selectively inhibit DNA polymerase activity at temperatures below 40°C and have been shown to function in Hot Start applications. Dessa selektivt hämmar DNA-polymeras aktivitet vid temperaturer under 40 ° C och har visat sig fungera i Hot Start ansökningar. Alternatively, one can use an antibody against Taq DNA polymerase. Alternativt kan man använda en antikropp mot Taq DNA-polymeras. The antibody inhibits the DNA polymerase until the temperature of the PCR is such that the antibody is denatured at a temperature greater than 55°C, thereby releasing the enzyme. Antikroppen hämmar DNA-polymeras tills temperaturen i PCR är sådan att antikroppen är denaturerad med en temperatur högre än 55 ° C och därmed frigöra enzymet. However there are disadvantages to this type of Hot Start conditions. Men det finns nackdelar med denna typ av Hot Start villkor. In this case, one needs an antibody for each different enzyme used in a PCR and for a large number of PCRs this can rise costs significantly. I det här fallet ett behov av en antikropp för varje olika enzym som används i ett PCR och för ett stort antal PCRs detta kan öka kostnaderna avsevärt. The most convenient form of Hot Start is to modify the DNA polymerase in such a way that it is inactive at room temperature (temperature-sensitive mutant), and is only re-activated following incubation at 95°C for 6-15 minutes (23). Det bekvämaste form av Hot start är att ändra DNA-polymeras på ett sådant sätt att det är inaktiv i rumstemperatur (temperaturkänsliga mutant) och är endast åter aktiveras efter inkubation vid 95 ° C i 6-15 minuter (23 ).
Because of its simplicity, PCR is a popular technique with a wide range of applications På grund av dess enkelhet, PCR är en populär teknik med ett stort antal tillämpningar
including direct sequencing, genomic cloning, DNA typing, detection of infectious microorganisms, site-directed mutagenesis, prenatal genetic disease research, and analysis of allelic sequence variations (1,7,13,16) which depend on essentially three major advantages of the method: inklusive direkta sekvensering, arvsmassans kloning, DNA-typning, detektion av infektiösa mikroorganismer, site-directed mutagenes, prenatal genetisk sjukdom forskning och analys av allelic sekvens variationer (1,7,13,16) som är beroende av i huvudsak tre stora fördelarna med metoden :
Speed and ease of use: DNA cloning by PCR can be performed in a relatively short amount of time, within a few hours. Usually, a PCR reaction consists of around 30 cycles each cycle containing a denaturation, synthesis and reannealing step, with an individual cycle typically taking 3 Hastighet och användarvänlighet: DNA kloning av PCR kan utföras på relativt kort tid, inom några timmar. Vanligtvis en PCR-reaktionen består av runt 30 gånger varje cykel innehåller en denaturering, syntes och reannealing steg, med en individuell cykel normalt tar 3 
5 min in an automated thermal cycler. This is clearly quicker than the time required for cell-based DNA cloning, which could take weeks of time. Furthermore, it is quite easy to setup a PCR reaction and the use of a thermocycler machine is also easy. Some time is required for the design and synthesis of oligonucleotide primers, but this has been simplified by the availability of computer software for primer design and rapid commercial or academic synthesis of custom oligonucleotides. Optimization of PCR conditions may be required such as primer annealing temperature, magnesium concentration, and primer concentration. However, the creation of gradient PCR machines which allow a variety of primer annealing temperatures to be tested at the same time has greatly decreased the time required for this step. 5 min i en automatiserad termocykler. Det är klart snabbare än den tid som krävs för cell-baserad DNA kloning, vilket kan ta veckor för sent. Dessutom är det ganska enkelt att konfigurera en PCR-reaktion och användning av en termocykler maskinen är också lätt. Några tid krävs för design och syntes av oligonukleotidprimers, men detta har förenklats genom att tillgången på mjukvara för primer design och snabb kommersiell eller akademiska syntes av anpassade oligonucleotides. Optimering av PCR villkor kan behövas som grundfärg annealing temperatur, magnesium koncentration, och primrar. Men skapandet av lutning PCR-maskiner som möjliggör en mängd primer annealing temperaturer som skall provas samtidigt har kraftigt minskat den tid som krävs för detta steg. Once the optimal conditions for a reaction have been obtained, the reaction can then be simply repeated (1,7,13,16). När de optimala förhållandena för en reaktion har erhållits reaktionen kan sedan enkelt upprepas (1,7,13,16).
Sensitivity: PCR is capable of amplifying sequences from minute amounts of target DNA, even the DNA from a single cell (24). Such exquisite sensitivity has afforded new methods of studying molecular pathogenesis and has found numerous applications in forensic science, in diagnosis, in genetic linkage analysis using single-sperm typing and in molecular paleontology studies, where samples may contain minute numbers of cells. Känslighet: PCR kan komplettera sekvenser från minut mängder av mål-DNA, även DNA från en enda cell (24). Sådana utsökt känslighet har gett nya metoder för att studera molekylär patogenes och har funnit många tillämpningar inom kriminaltekniken, diagnos, i Genetic linkage analysis använder enda spermie skriva och i molekylär paleontology studier, där prover kan innehålla minut antal celler. However, the extreme sensitivity of the method means that great care has to be taken to avoid contamination of the sample under investigation by external DNA, such as from minute amounts of cells from the operator (1,7,13,16). Men den extrema känsligheten hos den metod som innebär att stor försiktighet måste iakttas för att undvika kontaminering av provet under utredning av externa DNA, till exempel från små mängder av celler från operatören (1,7,13,16).
Robustness: A broad range of nucleic acid sources are suitable templates for PCR amplification. Purified DNAs from various species and sources have been amplified. PCR can permit amplification of specific sequences from material in which the DNA is badly degraded or embedded in a medium from which conventional DNA isolation is problematic. Robustness: Ett brett spektrum av nukleinsyra källor är lämpliga mallar för PCR-amplifiering. Renat utsedda nationella myndigheter från olika arter och källor har förstärkts. PCR kan tillåta amplifiering av specifika sekvenser från material där DNA är illa förstörd eller inbäddade i ett medium som konventionella DNA isolering är problematiskt. As a result, it is again very suitable for molecular anthropology and paleontology studies, for example the analysis of DNA recovered from archaeological remains. Som ett resultat är det återigen mycket lämplig för molekylär antropologi och paleontology studier, till exempel analys av DNA återkrävas från arkeologiska lämningar. It has also been used successfully to amplify DNA from formalin-fixed or paraffin-embedded tissue samples, which has important applications in molecular pathology and, in some cases, genetic linkage studies. Det har också använts framgångsrikt för att komplettera DNA från formalin-fast eller paraffin-inbäddade vävnadsprover, som har viktiga tillämpningar inom molekylär patologi och i vissa fall, Genetic linkage studies. Generally, the success of PCR amplification is greatest when target fragments are relatively abundant (1,7,13,16). Generellt sett är framgången för PCR-amplifiering är som störst när målet fragment är relativt riklig (1,7,13,16).
Despite its huge popularity, PCR has certain limitations as a method for selectively cloning specific DNA sequences. Trots dess enorma popularitet, PCR har vissa begränsningar som en metod för att selektivt kloning specifika DNA-sekvenser.
In order to construct specific oligonucleotide primers that permit selective amplification of a particular DNA sequence, some prior sequence information is usually necessary. För att bygga särskilda oligonukleotidprimers att tillåta selektiv amplifiering av en viss DNA-sekvens, vissa före sekvensinformation är oftast nödvändigt. This normally means that the DNA region of interest has been partly characterized previously, often following prior cell-based DNA cloning. Detta innebär normalt att DNA-regionen av intresse har delvis karakteriseras som tidigare, ofta efter föregående cell-baserad DNA kloning. However, a variety of approaches have been developed that reduce or even exclude the need for prior DNA sequence information concerning the target DNA. Previously uncharacterized DNA sequences can sometimes be cloned using PCR with degenerate oligonucleotides if they are members of a gene or repetitive DNA family at least one of whose members has previously been characterized. Men en rad olika metoder har utvecklats till att minska eller helt utesluta behovet av före DNA-sekvens information om mål-DNA. Tidigare Okarakteriserade DNA-sekvenser kan ibland vara klonade med hjälp av PCR med degenererade oligonucleotides om de är medlemmar av en gen eller repetitiva DNA-familjen minst en av medlemmarna har tidigare karaktäriserats. In some cases, PCR can be used effectively without any prior sequence information concerning the target DNA to permit indiscriminateamplification of DNA sequences from a source of DNA that is present in extemely limited quantities. I vissa fall PCR kan användas effektivt utan föregående sekvens information om mål-DNA för att möjliggöra indiscriminateamplification av DNA-sekvenser från en källa till DNA som finns i extemely begränsade kvantiteter. Therefore, although PCR can be applied to ensure whole genome amplification, it does not have the advantage of cell-based DNA cloning in offering a way of separating the individual DNA clones comprising a genomic DNA library. Därför, trots att PCR kan användas för att garantera hela genamplifieringsteknik har det inte någon fördel för cell-baserad DNA kloning i att erbjuda ett sätt för att urskilja de enskilda DNA-kloner som består av en genomiskt DNA bibliotek.
The amount of PCR product obtained in a single reaction is also much more limited than the amount that can be obtained using cell-based cloning where scale-up of the volumes of cell cultures is possible. Beloppet av PCR-produkt som framställs i en enda reaktion är också mycket mer begränsat än det belopp som kan uppnås med hjälp av cell-baserad kloning där skala upp volymerna av cellkulturer är möjligt. The efficiency of a PCR reaction will vary from template to template and according to various factors that are required to optimize the reaction but typically only comparatively small amounts of product are achieved. Effektiviteten i en PCR-reaktionen kommer att variera från mall till mall och beroende på olika faktorer som krävs för att optimera reaktionen men vanligtvis endast jämförelsevis små mängder av produkten uppnås.
Although the theoretical yield of PCR is exponential, the actual yield of a PCR is much less indicating that the scheme is operating with less than its maximum potential. For example, the amount of product at each cycle eventually levels off. This plateau may be explained by the following phenomena. First, some of the template may never be available due to strand breaks or failure of the DNA to dissociated from other macromolecules during purification and the initial thermocycles. Secondly, the amount of enzyme is finite and eventually activity may decrease. Thirdly, as the concentration of the double-stranded product reaches high levels, competition increases between annealing of template (PCR product) to primer and reannealing of the complementary template strands (1,7,13). Även om den teoretiska avkastningen av PCR är exponentiell, den faktiska avkastningen av en PCR är mycket mindre som visar att systemet fungerar med mindre än sin maximala potential. Exempelvis är mängden som vid varje cykel småningom nivåer off. Platå kan förklaras med följande fenomen. Först några av de mall kan aldrig vara tillgängliga på grund av strängbrott eller fel av DNA att skilja från andra molekyler under reningen och den ursprungliga thermocycles. För det andra, den mängd enzym är ändliga och så småningom aktivitet kan minska. Tredje, som den koncentration av double-stranded produkt når höga nivåer, konkurrensen ökar mellan annealing av mallen (PCR-produkt) till grundfärg och reannealing av kompletterande mallen delar (1,7,13).
An obvious and many times great disadvantage of PCR as a DNA cloning method has been the size range of the DNA sequences that can be cloned. En självklar och många gånger stor nackdel med PCR som en DNA kloning metod har storleksintervallet av DNA-sekvenser som kan klonas. Unlike cell-based DNA cloning where the size of cloned DNA sequences can approach 2 Mb, reported DNA sequences cloned by PCR have typically been in the 0.1 Till skillnad från cell-baserad DNA kloning där storleken av klonat DNA-sekvenser kan metod 2 Mb, rapporterade DNA-sekvenser klonade av PCR har vanligtvis i 0,1 
5 kb size range, often at the lower end of this scale. 5 kb storleksordning, ofta i nedre delen av denna omfattning. Small fragments of DNA can usually be amplified easily by PCR, however it becomes increasingly more difficult to obtain efficient amplification as the desired product length increases. Små bitar av DNA kan oftast förstärks lätt av PCR Men det blir allt svårare att få fram effektiva förstärkare som den önskade produkten längd ökar. Barnes (25) recognized a target length limitation to PCR amplification of DNA. He used a combination of a high level of an exonuclease-free, N-terminal deletion mutant of Taq DNA polymerase, Klentaq1, with a very low level of a thermostable DNA polymerase exhibiting a 3'-exonuclease activity (Pfu, Vent, or Deep Vent) to conduct high fidelity long PCR. Barnes (25) erkänt ett mål längd begränsning till PCR-kopiering av DNA. Han använde en kombination av en hög grad av en exonuclease-free, N-terminalen utgår mutant av Taq DNA-polymeras, Klentaq1, med en mycket låg nivå av en thermostable DNA polymeras som uppvisar en 3'-exonuclease aktivitet (PFU, Vent, eller Deep Vent) genomföra High fidelity lång PCR. At least 35 kb of bacteriophage lambda can be amplified to high yields from 1 ng of lambda DNA template. Use of this method yielded increased base-pair fidelity, the ability to use PCR products as primers, and the maximum yield of target fragment. Other conditions have been identified for effective amplification of longer targets, including amplification of up to 22 kb of the beta-globin gene cluster from human genomic DNA and up to 42 kb from phaga lambda DNA (26). Minst 35 kb av bakteriofag lambda kan förstärks till hög avkastning från 1 ng av lambda DNA-mall. Användning av denna metod gett ökade base-pair trohet, förmågan att använda PCR-produkter som grundfärg, och den högsta avkastningen av mål-fragment. Andra villkor har fastställts för en effektiv förstärkning av längre mål, bland annat förstärkning av upp till 22 kb av beta-globingenen kluster av mänskliga arvsmassans DNA och upp till 42 kb från phaga lambda-DNA (26). The conditions for these long PCRs included increased pH, addition of glycerol and dimethyl sulfoxide, decreased denaturation times, increased extension times, and the use of a secondary thermostable DNA polymerase that possesses a 3'-to 5'-exonuclease, or "proofreading," activity. Villkoren för dessa långa PCRs ingår ökade pH, tillsats av glycerol och dimetylsulfoxid, minskade denaturering gånger, ökad utbyggnad gånger, och användning av en sekundär thermostable DNA-polymeras som besitter en 3'-5'-exonuclease, eller "korrekturläsning, "Verksamhet. The "long PCR" protocol maintained the specificity required for targets in genomic DNA by using lower levels of polymerase and temperature and salt conditions for specific primer annealing. The ability to amplify DNA sequences of 10-40 kb will bring the speed and simplicity of PCR to genomic mapping and sequencing and facilitate studies in molecular genetics (26). Generally, the conditions for long range PCR involve a combination of modifications to standard conditions with a two-polymerase system. Den "långa PCR" protokoll bibehöll specificitet för mål i arvsmassans DNA genom att använda lägre polymeras och temperatur och salthalt villkor för specifika primer annealing. Förmågan att komplettera DNA-sekvenser i 10-40 kb ger snabbhet och enkelhet PCR att sekvenseringen och sekvensering och underlätta studier i molekylär genetik (26). Generellt är villkoren för långväga PCR innebär en kombination av ändringar av standardvillkor med en två-polymeras. This provides optimal levels of DNA polymerase and 3’to 5’ exonuclease activity which serves as a proofreading mechanism (16). Detta ger optimala nivåer av DNA-polymeras och 3'to 5 "exonuclease verksamhet som fungerar som en korrekturläsning mekanism (16).
Thermocyclers which automatically regulate temperatures for PCR cycling were introduced in 1986 (Figure 6). In addition to the advances in PCR reagents, new instruments for automated thermal cycling and for analyzing PCR products have been developed. New thermal cyclers have increased rates of heating, cooling, and heat transfer to modified reaction vessels. The reaction vessels accommodated by the first generation thermal cyclers (or even water baths and heating blocks) were standard plastic microfuge tubes. PCR amplification in thin capillary tubes allowed rapid thermal cycling, and DNA synthesis to 20s. The speed of the temperature changes achieved in these systems has allowed the precise definition of temperature optima for each individual step in the PCR cycle. The new generation thermal cyclers also accommodate more samples, have more precise thermal profiles, and are programmable (13). Thermocyclers som automatiskt reglerar temperaturen för PCR cykling infördes år 1986 (Figur 6). Utöver de framsteg inom PCR-reagenser, nya instrument för automatisk termisk cykling och för analys av PCR-produkter har utvecklats. New thermal cyclers har ökat andelen uppvärmning, kyla och värme överföring till modifierade reaktion fartyg. Reaktionen fartyg tillgodoses genom den första generationen thermal cyclers (eller rent vatten bad och värme block) var standard plast mikrocentrifugrör rör. PCR-kopiering i tunna capillary tubes tillåtet snabb termisk cykling, och DNA-syntes till 20s. Hastigheten på temperaturen förändringar som uppnåtts i dessa system har gjort att den exakta definitionen av temperatur Optima för varje enskilt steg i PCR-cykeln. Den nya generationen thermal cyclers också ta fler prover, få mer exakta termiska profiler, och är programmerbar (13 ).
One of the least appreciated contributions to the widespread application of PCR has been the development of reliable automated chemistry for oligonucleotide synthesis. Until recently, the construction of a single oligonucleotide was a substantial task that could only be performed by a skilled organic chemist. Now it is possible to purchase either an oligonucleotide synthesizer that can be operated by a technician or the oligonucleotides themselves from a commercial or academic source. Multiplex oligonucleotide synthesis machines have been constructed with the aim of reducing the overall cost of synthesis (27,28). En av de minst uppskattade bidrag till den utbredda tillämpningen av PCR har varit att utveckla tillförlitliga automatiserade kemi för oligonucleotide synthesis. Fram till nyligen, byggande av en enda oligonucleotide var en stor uppgift som endast kan utföras av en kunnig organisk kemist. Nu är är möjligt att köpa antingen en oligonucleotide synthesizer som kan drivas av en tekniker eller oligonucleotides sig från kommersiell eller akademiska källa. Många oligonucleotide synthesis maskiner har konstruerats i syfte att minska de totala kostnaderna för syntes (27,28). As the oligonucleotides define the eventual PCR products, there is little doubt that in the absence of their ready supply, PCR would not have enjoyed the wide acceptance that it has gained today (13). Som oligonucleotides definiera eventuella PCR-produkter, råder föga tvivel om att i avsaknad av sin redo leverans, PCR skulle inte ha haft den breda genomslag som den har fått i dag (13).
Researchers agreed early on that the design of PCR primers was difficult and unreliable. Computer programs were devised to take all of the design criteria into account. Forskare enades tidigt om att konstruktionen av PCR primers var svårt och otillförlitliga. Datorprogram utarbetades för att ta alla de design kriterier i beaktande. One of the first programs written for primer design was Olga which made use of the implementation of Digital Research GEM (Graphics Environment Manager) on the Atari ST (29). En av de första program skrivna för primer design var Olga som utnyttjat genomförandet av Digital Research GEM (Graphics Environment Manager) på Atari ST (29). Olga was specifically suited to the polymerase chain reaction (PCR) allowing simultaneous analysis of two primer sequences. Olga var som lämpar sig särskilt polymeraskedjereaktion (PCR) möjliggör samtidig analys av två primer sekvenser. The advantage of Olga was that it provided in one program analyses for direct repeats, secondary structures and primer dimerization as well as several useful 'finishing' tools for workers engaged in PCR optimization and oligonucleotide syntheses. The Primer3 program at the Whitehead Institute is now thought to be the most reliable and versatile tool currently available (30). Fördelen med Olga var att det i ett program analyser för direkt upprepar, sekundära strukturer och primer dimerization samt flera nyttiga "efterbehandling" verktyg för arbetstagare i PCR-optimering och oligonucleotide synteser. Primer3 programmet vid Whitehead Institute är nu trodde vara den mest tillförlitliga och användbara verktyg för närvarande finns tillgängliga (30).
PCRs can now be performed enabling the amplification of DNA fragments up to several kilobases in length by more than one million times their initial abundance. The procedure is highly automatable and requires just a few hours from beginning the thermocyling to product analysis. This was not the case previously, and the practical requirements for performing a PCR have been greatly simplified since the first manuscripts of the method (13). Today, most of the initial hitches or inefficiencies of the PCR have been worked out (8). Furthermore, PCR has expanded to include more than 270,000 articles (31). PCRs kan nu utföras som gör det möjligt för amplifiering av DNA-fragment upp till flera kilobases i längd med mer än en miljon gånger sin ursprungliga överflöd. Förfarandet är i hög grad automatiserade och kräver bara några timmar från början till thermocyling att produkten analys. Detta var inte fallet tidigare, och de praktiska kraven för att utföra ett PCR har kraftigt förenklat sedan första manuskript av metoden (13). Idag är de flesta av de ursprungliga fästen eller ineffektivitet av PCR har utarbetats (8). Dessutom PCR har utvidgas till att omfatta mer än 270000 artiklar (31).
Polymerase chain reaction is the most widely used method for in vitro DNA amplification however it requires thermal denaturation or thermocycling to separate the two DNA strands. In vivo , DNA is replicated by DNA polymerases with various accessory proteins. DNA helicase, a DNA polymerase accessory proteins acts to separate duplex DNA inside cells. Vincent et al. (32) have devised a new in vitro isothermal DNA amplification method by mimicking the in vivo replication mechanism. Helicase-dependent amplification (HDA) utilizes a DNA helicase to generate single-stranded templates for primer hybridization. Subsequent primer extension is then catalyzed by a DNA polymerase. HDA does not require an expensive thermocycler and thus PCR may be performed practically anywhere. In addition, it offers several advantages over other isothermal DNA amplification methods by having a simple reaction scheme and being a true isothermal reaction that can be performed at one temperature for the entire process. HDA offers great promise in the development of simple portable DNA diagnostic devices to be used in the field and at the point-of-care (32).
It is said the simplest and most convenient way to define PCR is as a technique . However, such a categorization eliminates the history of PCR's development as many individuals over the years contributed to the ideas behind the theory of PCR and the fine-tuning of the technique. The next simplest answer is to name an individual as the inventor of the polymerase chain reaction. Karry Mullis was awarded the Nobel Prize for Chemistry in 1993 for his discovery of PCR. However, this discovery is contested amongst many scientists, all of which may have contributed to unlocking this puzzle.
It has also been said that PCR did not exist until it was made to work in an experimental system. With this in mind, merely the thought of a concept is not sufficient; a concept must have been successfully been put into practice (33).
Although there is doubt as to the ultimate creator of PCR, and doubt as to the possibility that PCR may somehow or sometime be replaced, there is little doubt the impact that PCR has created over a short time span on the study of molecular biology and life.
References
1. Arnheim, N; Erlich, H; Polymerase Chain Reaction Strategy. ANNUAL REVIEW OF BIOCHEMISTRY, VOL. 61. XIV+1359P. , 1992. p. 131-156.
2. Appenzeller T. Democratizing the DNA sequence., Science , 1990 Mar 2, 247(4946).
3. Saiki R, K.; Scharf S; Faloona F; Mullis K. B; Horn G. T; Erlich HA; Arnheim N., Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science , 1985 Dec 20, 230(4732):1350-4.
4. Southern, EM (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-518.
5. Mullis K. B; Faloona F. A; Scharf S; Saiki R. K; Horn G; Erlich HA, Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology , 1986
6. Mullis K. B; Faloona FA Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology , 1987, 155:335-50.
7. Gibbs, RA; DNA Amplification by the Polymerase Chain Reaction. Analytical Chemistry, 1990, 62:1202-1214.
8. Mullis, KB; The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction, Scientific American, April 1990.
9. Kleppe, KE; Khorana , HG; (1971) J. Mol. Biol. 56, 341-346.
10. Keir, H; DNA polymerases from mammalian cells. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1965;4:81-128.
11. Fansler, BS; Eukaryotic DNA polymerases: their association with the nucleus and relationship to DNA replication. Int Rev Cytol. 1974;Suppl 4:363-415.
12. Saiki R. K; Gelfand D. H; Stoffel S; Scharf S. J; Higuchi R; Horn G. T; Mullis K. B; Erlich HA. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science , 1988 Jan 29, 239(4839):487-91.
13. Erlich, H. A; Gelfand, D; Sninsky, JJ Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction., Science , 1991, v.252, n.5013, 1643-1651.
14. Williams, JF; Optimization strategies for the polymerase chain reaction. Biotechniques. 1989 Jul-Aug;7(7):762-9.
15. Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Qian J, Wallace RB. The effect of temperature and oligonucleotide primer length on the specificity and efficiency of amplification by the polymerase chain reaction. DNA Cell Biol. 1991 Apr;10(3):233-8.
16. Strachan, T; Read AP; Human Molecular Genetics 2 . 1999. John Wiley & Sons Inc. Chapter 6 Section 1.
17. Scharf S. J; Horn G. T; Erlich HA Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequences. Science , 1986 Sep 5, 233(4768):1076-8.
18. Cline J, Braman JC, Hogrefe HH; PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 1996 Sep 15;24(18):3546-51.
19. Falooea, F., Weiss, S., Ferre, F., Mullis, K. 1990 6th Int.Conf . AIDS . Abstr.
20. D’Aquila, RT, Bechtel, LJ, Videler, JA, Eron, JJ, Goeczyca, P., Kaplan, JC 1991. Nucleic Acids Res. 19:3749.
21. Dang C, Jayasena SD. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. J Mol Biol. 1996 Nov 29;264(2):268-78.
22. Kellogg DE, Rybalkin I, Chen S, Mukhamedova N, Vlasik T, Siebert PD, Chenchik A. TaqStart Antibody: "hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase. Biotechniques. 1994 Jun;16(6):1134-7.
23. Kermekchiev MB, Tzekov A, Barnes WM. Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR. Nucleic Acids Res. 2003 Nov 1;31(21):6139-47.
24. H. Li, UB Gyllenstein, X. Cui, RK Saiki, H. Ehrlich, and N. Arnheim. (1988). Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells Nature 335: 414-417.
25. Barnes WM.; PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates. Proc Natl Acad Sci US A. 1994 Mar 15;91(6):2216-20.
26. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA. Proc Natl Acad Sci US A. 1994 Jun 7;91(12):5695-9.
27. Caruthers MH, Barone AD, Beaucage SL, Dodds DR, Fisher EF, McBride LJ, Matteucci M, Stabinsky Z, Tang JY. Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. Methods Enzymol. 1987;154:287-313.
28. Beattie KL, Logsdon NJ, Anderson RS, Espinosa-Lara JM, Maldonado-Rodriguez R, Frost JD 3rd. Gene synthesis technology: recent developments and future prospects. Biotechnol Appl Biochem. 1988 Dec;10(6):510-21.
29. Bridges CG. Olga--oligonucleotide primer design program for the Atari ST. Comput Appl Biosci. 1990 Apr;6(2):124-5.
30. Rozen S, Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 2000;132:365-86.
31. Location world wide web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed Search: “PCR”
32. Vincent M, Xu Y, Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004 Aug;5(8):795-800. Epub 2004 Jul 09.
33. Paul Rabinow. Making PCR, A Story of Biotechnology , University of Chicago Press, 1996
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved.
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
