Molecular Biology Blog Molekylärbiologi Blog

Assaying DNA- Protein Interactions Att analysera DNA-protein interactions

Learn about how to assay DNA-protein interactions. Läs om hur du assay DNA-protein interaktioner.

Assaying DNAProtein Interactions Analysera DNAProtein Interactions

There are four important techniques for assaying DNA-protein interactions. Det finns fyra viktiga tekniker för att analysera DNA-protein interaktioner. The first two techniques (Filter Binding and Gel Mobility Shift) determine if your DNA is interacting with protein. De första två tekniker (Filter Bindning och Gel Mobility Shift) avgöra om din DNA är att interagera med protein. The other two techniques (DNase Footprinting and DMS Footprinting) indicate where the target site of interaction between protein and DNA lies on the DNA. De två andra tekniker (DNase Footprinting och DMS Footprinting) ange var målsidan interaktioner mellan protein och DNA som ligger på DNA.

Filter Binding Filter Bindande

Nitrocellulose membrane filters are commonly used to filter-sterilize solutions. Nitrocellulosa membranfilter allmänt används för att filtrera-sterilize lösningar. Nitrocellulose filters can bind DNA, but only under certain conditions. Nitrocellulosa filter kan binda DNA, men bara under vissa villkor. Singlestranded DNA binds readily to nitrocellulose, but double stranded DNA by itself does not. Singlestranded DNA binder lätt att nitrocellulosa, men double stranded DNA i sig inte. On the other hand protein does bind, and if a protein is bound to double-stranded DNA the protein-DNA complex will bind. Å andra sidan protein har bindande, och om ett protein som är bundet till dubbla DNA till protein-DNA-komplex är bindande. Please refer to Nitrocellulose Filter Binding Assay article for more information. Referera till Nitrocellulosa Filter Bindande Assay artikel för mer information.

Gel Mobility Shift Gel Mobility Shift

In order to measure DNA-protein interactions this technique relies on the simple fact that a small DNA has a much higher mobility in gel electrophoresis than the same DNA does when it is bound to a protein. För att mäta DNA-protein interaktioner denna teknik bygger på det enkla faktum att ett litet DNA har en mycket större rörlighet i gelelektrofores än samma DNA har när det är bundet till ett protein. We therefore can label a sort double stranded DNA fragment, then mix it with a protein, and electrophorese the complex. Vi kan märka ett slags dubbla DNA-fragment, sedan blandas det med ett protein, och electrophorese de komplexa. Then we subject the gel in autoradiography to detect the labeled species. Då vi utsätter gelen i autoradiografi att upptäcka heter arter. The small size of the DNA is important in this assay. Den lilla storleken på DNA är viktigt i den här analysen. If a whole gene were used its mobility would already be very low, and the mobility shift caused by protein binding would be difficult to detect. Om en hel gen användes dess mobilitet skulle redan vara mycket låg, och rörligheten förskjutning som orsakas av proteinbindning skulle vara svårt att upptäcka. Therefore we must know approximately where the protein binds to the DNA so we can prepare a short restriction fragment, or even a synthetic double-stranded oligonucleotide that will contain the target site for the protein, but little else. Därför måste vi vet ungefär när proteinet binder till DNA så att vi kan förbereda en kort begränsning fragment, eller ens en syntetisk double-stranded oligonucleotide som ska innehålla målsidan för protein, men lite annat.

DNase Footprinting DNase Footprinting

Once we know that a protein binds to a given DNA we can use footprinting to find out where the target site lies on the DNA. När vi vet att ett protein binder till en viss DNA som vi kan använda Footprinting att ta reda på var målet webbplats ligger på DNA. Dnase footprinting relies on the fact that a protein, by binding to DNA, covers the binding site and so protects it from attack by Dnase. Dnase Footprinting bygger på det faktum att ett protein, genom att binda till DNA, omfattar bindning och så skyddar den från angrepp från Dnase. In this sense it leaves a "footprint" on the DNA. I den bemärkelsen att det lämnar ett "fotavtryck" i DNA. The first step in a footprinting experiment is to end-label the DNA. Det första steget i en Footprinting experimentet är att end-etikett DNA. We can label either strand, but only one per experiment. Vi kan märka antingen strand, men endast en per försök. Next, we bind the protein to the DNA. Nästa, vi binder proteinet till DNA. Then we treat the DNA-protein complex with Dnase I under mild conditions (very little Dnase), so that an average of only one cut occurs per DNA molecule. Då behandlar vi det DNA-protein komplex med Dnase I under milda villkor (mycket lite Dnase), så att ett genomsnitt av endast en nedskärning sker per DNA-molekylen. Next, we remove the protein from the DNA, separate the DNA strands, and electrophorese the resulting fragments on a high resolution polyacylamide gel alongside size markers. Nästa tar vi bort det protein från DNA, separera DNA-strängar, och electrophorese den resulterande fragment på en högupplöst polyacylamide gel vid sidan storlek markörer. Fragments will arise from the other end of the DNA as well, but we will not detect them because they are unlabeled. Fragment kommer att uppstå från den andra änden av DNA också, men vi kommer inte att upptäcka dem eftersom de är omärkta. We always include a control with DNA alone (no protein), and usually use more than one protein concentration so we can see by the gradual disappearance of the bands in the footprint region that protection of the DNA depends on the concentration of the added protein. Vi har alltid omfatta en kontroll med DNA ensam (ingen protein), och vanligtvis använda mer än ett protein koncentration så vi kan se av den gradvisa försvinnandet av de band i fotavtryck regionen att skyddet av DNA beror på koncentrationen av det tillsatta proteinet. The footprint represents the region of DNA protected by the protein, and therefore tells us where the protein binds. Mottagningsområde som representerar regionen DNA skyddas av protein, och därför berättar om protein binder.

DMS Footprinting DMS Footprinting

Dnase footprinting gives a good idea of the location of the binding site for the protein, but Dnase is a macromolecule and is therefore a rather blunt instrument for probing the fine details of the binding site. Dnase Footprinting ger en god uppfattning om lokaliseringen av bindning till proteinet, men Dnase är en makromolekyl och är därför ett ganska trubbigt instrument för djupgående de fina detaljerna i bindande webbplats. Which means, that there may be gaps in the interaction between protein and DNA that Dnase would not fit into and therefore would not detect. Vilket innebär att det kan finnas luckor i samspelet mellan protein och DNA som Dnase inte skulle passa in i och därför inte skulle upptäcka. Moreover, DNA binding proteins frequently perturb the DNA within the binding region, distorting the double helix. Dessutom har DNA-bindande proteiner som ofta stör DNA inom bindande regionen, snedvrider spiralen. These perturbations are interesting, but are not generally detected by Dnase footprinting because the protein keeps the Dnase away. Dessa störningar är intressant, men vanligtvis inte upptäckts av Dnase Footprinting eftersom proteinet håller Dnase bort. To do more detailed footprinting, we need a smaller molecule that can fit into the nooks and crannies of the DNA-protein complex and reveal more of the subtleties of the interaction. För att göra mer detaljerade Footprinting, vi behöver en mindre molekyl som kan passa in i de nooks och crannies av DNA-protein komplex och visar mer av nyanser i samspelet. A favorite tool for this job is the methylating agent dimethylsulfate (DMS). En favorit verktyg för detta arbete är det metyleringsmedel dimethylsulfate (DMS).

With DMS footprinting we start off in the same way as in Dnase footprinting, by end-labeling the DNA and binding the protein. Med DMS Footprinting vi börja på samma sätt som i Dnase Footprinting, i slutet av uppmärkning av DNA och bindande proteinet. Then we methylate the DNA-protein complex with DMS, using a mild treatment so that on average only one methylation even occurs per DNA molecule. Då vi metanollösning DNA-protein komplex med DMS, med hjälp av en mild behandling så att i genomsnitt endast en metylering ens inträffar per DNA-molekylen. Next, we dislodge the protein, and treat the DNA with a reagent that removes methylated purines, creating apurinic sites (deoxyriboses without bases) on the DNA. Nästa vi rubba det protein och behandla DNA med en reagens som tar bort metyleras purines, skapa apurinic webbplatser (deoxyriboses utan baser) på DNA. Then we break the DNA at these apurinic sites. Då vi bryta DNA i dessa apurinic webbplatser. These reactions are the same as the Maxam-Gilbert DNA sequencing reactions. Dessa reaktioner är samma som Maxam-Gilbert DNA-sekvensering reaktioner. Finally we electrophorese the DNA fragments and autoradiograph the gel to detect the labeled DNA bands. Slutligen vi electrophorese DNA-fragment och autoradiograph gelen att upptäcka märkt DNA-banden. Each band ends next to a nucleotide that was methylated and thus unprotected by the protein. Varje band slutar bredvid en nukleotid som metyleras och därmed oskyddade av protein.

See the DNA Molecule in 3-Dimensions Se DNA-molekylen i 3-dimensioner

deoxyribonucleic acid

Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Disclaimer / Terms of Service | Privacy policy | © 2005-2007 Molecular Station.com, Alla rättigheter reserverade.

Send this page to a friend Skicka denna sida till en vän

Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Bioinformatik, protokoll, DNA-RNA-Protein Proteomics