home > dna > cdna-cloning > index.php hem> dna> cDNA-kloning> index.php
 |
|---|
Learn about cDNA cloning. Läs om cDNA kloning.
A cDNA (short for complemantary DNA or copy DNA) is a DNA copy of an RNA, usually an mRNA. En cDNA (kort för complemantary DNA eller kopiera DNA) är en DNA-kopia av en RNA, vanligtvis ett mRNA. Sometimes we want to make a cDNA library, a set of clones reprensenting as many as possible of the mRNAs in a given cell type at a given time. Ibland vill vi göra ett cDNA bibliotek, en uppsättning kloner reprensenting så många som möjligt av mRNA i en viss celltyp vid en viss tidpunkt. Such libraries can contain tens of thousands of different clones. Sådana bibliotek kan innehålla tiotusentals olika kloner. Other times, we want to make one particular cDNA- aclone containing a DNA copy of just one mRNA. Andra gånger vill vi göra en särskild cDNA-aclone innehåller en DNA-kopia av ett enda mRNA. This technique we use depends in part on which of these goals we wish to achieve. Denna teknik vi använder beror delvis på vilka av dessa mål vi vill uppnå.
If we want to build a cDNA library, we can use a simple but effective strategy that relies on a process called nick translation. Om vi vill bygga ett cDNA bibliotek, kan vi använda en enkel men effektiv strategi som bygger på en process som kallas smeknamn översättning. The essence of nick translation is the simultaneous removal of DNA ahead of a nick (a single-stranded DNA break) and synthesis of DNA behind the nick. Kärnan i nick översättning är ett samtidigt borttagande av DNA framför en nick (en enda DNA paus) och syntes av DNA bakom smeknamn. The net result is to move, or translate the nick in the 5'-3' direction. Nettoresultatet är att flytta eller översätta nick i 5'-3 'riktning. The enzyme we usually use the nick translation is E.coli DNA polymerase I, which has a 5'-3' exonuclease activity that allows the enzyme to degrade DNA ahead of the nick as it moves along. Det enzym vi vanligtvis använder nick översättning är E.coli DNA-polymeras I, som har en 5'-3 'exonuclease aktivitet som gör att enzymet att brytas ned DNA före det smeknamn som den rör sig.
The central part any cDNA cloning procedure is synthesis of the cDNA from an mRNA template using reverse transcriptase. Den centrala delen någon cDNA kloning är syntes av cDNA från en mRNA-mallen med hjälp av omvänt transkriptas. Reverse transcriptase is like any other DNA-synthesizing enzyme is that it cannot initiate DNA synthesis without a primer. Omvänt transkriptas är som alla andra DNA-syntes enzym är att de inte kan inleda DNA-syntesen utan primer. To get around this problem, we take advantage of the poly(A) tail at the 3'-end of most eukaryotic mRNAs and use oligo(dT) as the primer. För att komma runt detta problem, vi utnyttja de poly (A) svans vid 3'-slut mest eukaryot mRNA och använda oligo (DT) som grundfärg. The oligo(dT) is complementary to poly(A), so it binds to the poly(A) at the 3'-end of the mRNA and primes DNA synthesis, using the mRNA as a template. Den oligo (DT) är ett komplement till poly (A), så det binds till poly (A) vid 3'-slutet av mRNA och band DNA-syntesen, med hjälp av mRNA som mall.
After the mRNA has been copied, yielding a single-stranded DNA (the "first strand"), we partially degrade the mRNA with ribonuclease H (RNase H). Efter mRNA har kopierats, vilket ger en enkelsträngat DNA ( "första del"), som vi delvis försämra mRNA med ribonukleas H (RNase H). This enzyme degrades the RNA strand of an RNA/DNA hybrid- just what we need to begin to digest the RNA from our first strand cDNA. Detta enzym bryter ner RNA del av en RNA / DNA hybrid-precis vad vi behöver för att börja smälta de RNA från vår första del cDNA. The remaining RNA fragments serve as primers for making the "second strand," using the first as the template. De återstående RNA-fragment tjäna som grundfärg för att göra det "andra del," med hjälp av de första som mall. This is the nick-translation phase of the process and again, E. coli DNA polymerase I is the enzyme we use to carry out the nick-translation reaction. Detta är det nick-översättning fasen av processen och om igen, E. coli DNA-polymeras I är det enzym som vi använder för att utföra de nick-översättning reaktion. The net result is a double-stranded cDNA with a small fragment of RNA at the 5'-end of the second strand. Nettoresultatet är en dubbel-strandsatta cDNA med ett litet fragment av RNA vid 5'-slutet av den andra delen.
Our next task is to ligate the cDNA to a vector. Vår nästa uppgift är att ligate den cDNA till en vektor. This was easy with our pieces of genomic DNA cleaved with restriction enzymes, but cDNAs have no sticky ends. Detta var enkelt med våra bitar av arvsmassans DNA cleaved med begränsning enzymer, men cDNAs har inga klibbiga slutar. We can ligate blunt ends together, even though that is a relatively inefficient process. Vi kan ligate trubbiga ändar tillsammans, även om det är en relativt ineffektiv process. However, if we want the efficient ligation afforded by sticky ends, we can tack sticky ends (oligo[dC]) onto the cDNA, using an enzyme called terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) or simply terminal transferase and one of the deoxribonucleoside triphosphates. Men om vi vill ha en effektiv ligation ges genom klibbiga slutar, kan vi tack klistriga ändar (oligo [dC]) ut på cDNA med hjälp av ett enzym som kallas terminal deoxynucleotidyl transferase (TDT) eller helt enkelt terminal transferas och en av de deoxribonucleoside trifosfater. In the case, we use dCTP. I det fall använder vi dCTP. The enzyme adds dCMPs, one at a time, to the 3'-ends of the cDNA. Enzymet tillägger dCMPs, en i taget, till 3'-ändar av cDNA. In the same way, we attach oligo(dG) ends to our vector and allow the oligo (dC)s to anneal to the oligo(dG)s. På samma sätt fäster vi oligo (GD) slutar att våra vektorn och låta oligo (DC) s att glödga till oligo (GD) s. This brings the vector and cDNA together in a recombinant DNA that can be used directly for transformation. Detta gör att den vektor och cDNA tillsammans i en rekombinant DNA som kan användas direkt för omvandling. The base pairing between the oligonucleotide tails is strong enough that no ligation is required before transformation. Basen parning mellan oligonucleotide svansar är stark nog att ingen ligation krävs innan omvandlingen. The DNA ligase inside the transformed cells finally performs the ligation. De DNA Ligase inuti celler omvandlas slutligen utför ligation.
See the DNA Molecule in 3-Dimensions Se DNA-molekylen i 3-dimensioner
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Disclaimer / Terms of Service | Privacy policy | © 2005-2007 Molecular Station.com, Alla rättigheter reserverade.
Send this page to a friend Skicka denna sida till en vän
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
