Welcome to Molecular Station! Välkommen till Molekylär Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du måste registrera dig innan du kan posta i vårt forum eller använda vår avancerade funktioner. Register Now! Registrera dig nu! Its Free and Fast! Dess fria och Snabbt!

Already registered? Redan registrerad? Login now below. Logga in nu nedan.

User Name: Användarnamn:

Password: Lösenord:

Remember Me? Kom ihåg mig?

Already registered and Forgot your password? Redan registrerad och Har du glömt ditt lösenord? Click below to recover it. Klicka nedan för att återkräva det.

Recover Lost Password Återskapa förlorat lösenord

Join now - it's fast and free! Gå med nu - det är snabbt och gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station är den största nätverk av forskare, vetenskapsmän och vetenskap älskare var som helst!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

Bookmark Bookmark Site Bookmark Bookmark Site

Cell Transfection Cell transfektion

This Transfection site is your portal for all things related to the transfection of cells with DNA plasmid or vector, RNA whether siRNA or RNAi, or even recombinant protein. Detta transfektion webbplats är din portal för alla saker relaterade till transfektion av celler med DNA plasmid eller vektor, RNA huruvida tvärtom eller RNAi, eller till och med rekombinant protein. We provide you with all the background information, protocols for cell transfection, optimization and analysis steps, and cell transfection troubleshooting information to become the ultimate expert! Vi förser dig med all information, protokoll för cell transfection, optimering och analys steg och cell transfection felsökningsinformation att bli den ultimata expert!

Transfection Table of Contents Transfektion Innehållsförteckning

• What is transfection? Vad är transfektion?
• Background Bakgrund
• Applications Ansökningar
• Materials Material
• Transfection Methods Transfektion Methods
• Buffers Buffers
  
• Preparation Förberedelser
• Protocol Protokoll
• Other T ransfection Protocols Övriga T ransfection protokoll
• Discussion Topics for Transfection Diskussionsämnen för transfektion
• Get Help on your Transfection Problems Hjälp på din transfektion Problem
• Tips Tips
• Storing Förvaring
• Troubleshooting In Transfection Felsökning I transfektion
• References Referenser

What is Transfection? Vad är transfektion?

Transfection describes the introduction of foreign material into eukaryotic cells using a virus vector or other means of transfer. Transfektion beskriver införandet av främmande material i eukaryota celler med hjälp av ett virus vektor eller andra metoder för överlåtelse.

The term transfection for non-viral methods is most often used in reference to mammalian cells, while the term transformation is preferred to describe non-viral DNA transfer in bacteria and non-animal eukaryotic cells such as fungi, algae and plants. Termen transfektion för icke-virala metoder som oftast används vid hänvisning till däggdjursceller, medan termen transformation är att föredra för att beskriva icke-virala DNA-överföring i bakterier och icke-animaliskt eukaryota celler, såsom svampar, alger och växter.

Transfection of animal cells typically involves opening transient pores or 'holes' in the cell plasma membrane, to allow the uptake of material. Transfektion av celler normalt innebär inledande övergående porer eller "hål" i cell plasma membrane, för att möjliggöra utnyttjandet av materialet. Genetic material (such as supercoiled plasmid DNA or siRNA constructs), or even proteins such as antibodies, may be transfected. Genetiska material (t.ex. supercoiled plasmid DNA eller tvärtom konstruktioner), eller till och med proteiner såsom antikroppar, kan transfekterade. In addition to electroporation, transfection can be carried out by mixing a cationic lipid with the material to produce liposomes, which fuse with the cell plasma membrane and deposit their cargo inside. Förutom elektroporation, transfektion kan utföras genom att blanda en cationic lipid med material för att producera liposomer, som säkring med cell plasma membrane och deponera sina lasten inuti.

The original meaning of transfection was 'infection by transformation', ie introduction of DNA (or RNA) from a eukaryote virus or bacteriophage into cells, resulting in an infection. Den ursprungliga betydelsen av transfektion var "smitta genom ombildning", dvs införandet av DNA (eller RNA) från en eukaryote virus eller bakteriofag i cellerna, vilket resulterade i en infektion. Because the term transformation had another sense in animal cell biology (a genetic change allowing long-term propagation in culture, or acquisition of properties typical of cancer cells), the term transfection acquired, for animal cells, its present meaning of a change in cell properties caused by introduction of DNA. Eftersom termen transformation hade en annan känsla i zoologisk cellbiologi (en genetisk förändring möjliggör långsiktiga förökning i kultur, eller förvärv av fastigheter typiskt för cancerceller), termen transfektion förvärvats, för djurens celler, dess nuvarande innebörden av en förändring i cellen egenskaper på grund av införandet av DNA.

Transfection is a method by which experimental DNA may be put into a cultured mammalian cell. Transfektion är en metod som används vid experimentella DNA kan sättas in i en cultured mammalian cell. Such experiments are usually performed using cloned DNA containing coding sequences and control regions (promoters, etc) in order to test whether the DNA will be expressed. Sådana experiment brukar utföras med klonade DNA innehåller kodande sekvenser och kontroll regioner (initiativtagare, etc) för att testa om DNA kommer att anges. Since the cloned DNA may have been extensively modified (for example, protein binding sites on the promoter may have been altered or removed), transfection is often used to test whether a particular modification affects the function of a gene. Eftersom klonat DNA kan ha varit omfattande modifierade (t.ex. protein binding sites på promotorn kan ha ändrats eller tagits bort), transfektion ofta används för att testa om en viss modifiering påverkar funktionen av en gen.

Transfection Diagram: Transfektion Illustration:

Transfection Applications Transfektion Applications

The ability to synthesize RNA in the laboratory is critical to many techniques. Förmågan att syntetisera RNA i laboratoriet är kritiska till många tekniker. Radiolabeled and non-radiolabeled RNA probes are required for many protocols, and they can be synthesized easily in small scale in vitro transcription reactions allowing their use in blot hybridizations and nuclease protection assays. Radioaktivt och icke radioaktivt RNA-sonder krävs för många protokoll, och de kan syntetiserade lätt i liten skala in vitro transcription reaktioner att de får framföras i blot hybridizations och nuclease skydd analyser.

Requirements for Transfection? Krav för transfektion?

• Vector or DNA Vector eller DNA
• Cells Celler
• Transfection Reagent Transfektion Reagens

Optimizing Transfection Optimera transfektion

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium In vitro transcription kräver renat linjära DNA-mallen innehåller en promotor, ribonukleotid trifosfater, en buffert som omfattar DTT och magnesium

Which Transfection Reagent to Use? Vilka transfektion Reagens att använda?

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium In vitro transcription kräver renat linjära DNA-mallen innehåller en promotor, ribonukleotid trifosfater, en buffert som omfattar DTT och magnesium

Transfection Methods Transfektion Methods

There are various methods of introducing foreign DNA into a eukaryotic cell. Det finns olika metoder för införande av främmande DNA i en eukaryot cell. Many materials have been used as carriers for transfection, which can be divided into three kinds: (cationic) polymers, liposomes and nanoparticles. Många material har använts som bärare för transfektion, som kan delas in i tre typer: (katjoniska) polymerer, liposomer och nanopartiklar.

One of the cheapest (and least reliable) methods is transfection by calcium phosphate, originally discovered by FL Graham and AJ van der Eb in 1973[citation needed] (see also [1]). En av de billigaste (och minst tillförlitliga) metoder är transfektion av kalciumfosfater, ursprungligen upptäcktes av FL Graham och AJ van der Eb år 1973 [källa behövs] (se även [1]). HEPES-buffered saline solution (HeBS) containing phosphate ions is combined with a calcium chloride solution containing the DNA to be transfected. Hepes-buffrad saltlösning (HeBS) innehåller fosfat joner är kombinerad med en kalciumkloridlösning innehåller DNA som skall transfekterade. When the two are combined, a fine precipitate of the positively charged calcium and the negatively charged phosphate will form, binding the DNA to be transfected on its surface. När de två kombineras, böter fällning av positivt laddade kalcium och negativt laddad fosfat kommer att utgöra bindande DNA som skall transfekterade på dess yta. The suspension of the precipitate is then added to the cells to be transfected (usually a cell culture grown in a monolayer). Uppskjutandet av fällningen sedan läggas till de celler som skall transfekterade (vanligtvis en cellkultur som odlas i en monolayer). By a process not entirely understood, the cells take up some of the precipitate, and with it, the DNA. Genom en process inte helt förstått, de celler ta upp några av fällningen, och med det, DNA.

Other methods use highly branched organic compounds, so-called dendrimers, to bind the DNA and get it into the cell. Andra metoder använder mycket grenade organiska föreningar, så kallade dendrimers, att binda DNA och få in den i cellen. A very efficient method is the inclusion of the DNA to be transfected in liposomes, ie small, membrane-bounded bodies that are in some ways similar to the structure of a cell and can actually fuse with the cell membrane, releasing the DNA into the cell. En mycket effektiv metod är införande av det DNA som skall transfekterade i liposomer, dvs små, membran-avgränsas organ som är på vissa sätt liknar strukturen i en cell och kan faktiskt säkring med cellmembranet, befrielse för DNA in i cellen . For eukaryotic cells, lipid-cation based transfection is more typically used, because the cells are more sensitive. För eukaryota celler, lipid-ning bygger transfektion är mer normalt används, eftersom de celler är mer känsliga.

Another method is the use of cationic polymers such as DEAE-dextran or polyethylenimine. En annan metod är att använda sig av katjoniska polymerer som DEAE-dextran eller polyethylenimine. The negatively charged DNA binds to the polycation and the complex is taken up by the cell via endocytosis. De negativt laddad DNA binder till polycation och komplexa tas upp av cellen via endocytos.

A direct approach to transfection is the gene gun, where the DNA is coupled to a nanoparticle of an inert solid (commonly gold) which is then "shot" directly into the target cell's nucleus. En direkt metod för transfection är genen gun, där DNA kopplas till en nanoparticle av inert solid (allmänt guld) som sedan "skjutas" direkt i mål cellens kärna. DNA can also be introduced into cells using viruses as a carrier. DNA kan också föras in i cellerna med hjälp av virus som bärare. In such cases, the technique is called viral transduction, and, the cells are said to be transduced. I sådana fall är den teknik som kallas viral transduktion, och de celler som sägs vara transduced.

Other methods of transfection include nucleofection, electroporation, heat shock, magnetofection and proprietary transfection reagents such as Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene or DreamFect. Andra metoder för transfektion omfatta nucleofection, elektroporation, värme chock, magnetofection och patentskyddade transfektion reagenser som Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene eller DreamFect.

Stable vs Transient Transfection Methods Stabil vs Transient transfektion Methods

For most applications of transfection, it is sufficient if the transfected gene is only transiently expressed. För de flesta tillämpningar av transfektion, räcker det om transfekterade genen är bara transiently uttryckt. Since the DNA introduced in the transfection process is usually not inserted into the nuclear genome, the foreign DNA is lost at the later stage when the cells undergo mitosis. Eftersom DNA infördes i transfektion process är vanligtvis inte införas i det nukleära genomet, det främmande DNA som går förlorad vid senare skede när celler genomgå mitos. If it is desired that the transfected gene actually remains in the genome of the cell and its daughter cells, a stable transfection must occur. Om det är önskvärt att transfekterade gen som faktiskt finns kvar i arvsmassan av cellen och dess dotter-celler, en stabil transfektion ska inträffa.

To accomplish this, another gene is co-transfected, which gives the cell some selection advantage, such as resistance towards a certain toxin. För att åstadkomma detta, en annan gen som är co-transfekterade, vilket ger cellen några valbara fördel, såsom resistens mot ett visst toxin. Some (very few) of the transfected cells will, by chance, have inserted the foreign genetic material into their genome. Några (mycket få) av transfekterade celler, av en slump, har infogat främmande genetiskt material i sin arvsmassa. If the toxin, towards which the co-transfected gene offers resistance, is then added to the cell culture, only those few cells with the foreign genes inserted into their genome will be able to proliferate, while other cells will die. Om toxin, i riktning mot det gemensamma transfekterade gen som ger resistens, sätts därefter till cellodling, bara de få celler med främmande gener införs i deras arvsmassa kommer att kunna föröka sig, medan andra celler kommer att dö. After applying this selection pressure for some time, only the cells with a stable transfection remain and can be cultivated further. Efter att tillämpa detta val påtryckningar för lite tid, bara de celler med en stabil transfektion kvar och kan odlas längre.

A common agent for stable transfection is Geneticin, also known as G418, which is a toxin that can be neutralized by the product of the neomycin resistant gene. En gemensam representant för stabil transfektion är Geneticin, även kallat G418, som är ett toxin som kan neutraliseras genom att produkten av neomycin resistenta genen.

Which Transfection Reagent or Method to Use? Vilka transfektion Reagens eller metoden att använda?

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium In vitro transcription kräver renat linjära DNA-mallen innehåller en promotor, ribonukleotid trifosfater, en buffert som omfattar DTT och magnesium

Tips for Transfection Tips för transfektion

• Use RNAse inhibitors always! Använd RNAse hämmare alltid!
• Saving Money with T7 RNA Phage Polymerase: Clones with an N-terminal His-6 tag are available. Spara pengar med T7 RNA Phage polymeras: Clones med en N-terminal Hans-6-taggen finns tillgängliga. If you obtain this clone, you can purify large amounts of T7 polymerase with high activity (ref: He B, Rong M, Lyakhov D, Gartenstein H, Diaz G, Castagna R, McAllister WT, Durbin RK. Protein Expr Purif. 1997, 9, 142–151). Om du skaffar denna klon, kan du rena stora mängder T7 polymeras med hög aktivitet (ref: Han B, Rong M, Lyakhov D, Gartenstein H, Diaz G, Castagna R, McAllister WT, Durbin RK. Protein Expr Purif. 1997, 9, 142-151).
• To remove the DNA template, use an RNAse-free DNAse. För att ta bort det DNA-mallen, använd en RNAse-fri DNAse. We have used RQ1 DNase (Promega) added for 15 minutes and it works well. Vi har använt RQ1 DNase (Promega) läggas i 15 minuter och det fungerar bra.

Storing Trasfection Reagent Förvaring Trasfection Reagens

• RNA is best stored at a neutral pH with EDTA. RNA är bäst förvaras vid ett neutralt pH med EDTA.
• TE buffer is recommended (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA), however this should be prepared with RNAse free purified (preferablly Millipore water). TE buffert rekommenderas (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA), men detta bör vara förberedd med RNAse fria renat (preferablly Millipore vatten).

Troubleshooting Transfection Problems Felsökning transfektion Problem

Failed Transfections Kunde Transfections

• Old transfection reagent Gamla transfektion reagens
• Improperly stored transfection agent Felaktigt lagras transfektion agent
• Poor quality DNA or vector Dålig DNA eller vektor
• Insufficient DNA amount Otillräcklig DNA belopp
• Insufficient transfection reagent Otillräcklig transfektion reagens
• Too much DNA För mycket DNA
• Too much transfection reagent För mycket transfektion reagens

References on Transfection Referenserna transfektion

References on Transfection Referenserna transfektion

1. Bacchetti S, Graham F (1977). Bacchetti S, Graham F (1977). "Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA". "Överföring av genen för thymidine kinase att thymidine kinase-deficient mänskliga celler av renat herpes simplex virus-DNA". Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4. Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4. PMID 193108. PMID 193108.