Transfection клетки

Transfection описывает введение чужеродного материала в eukaryotic клетки используя вектор вируса или другие значения перехода.

Transfection термине для non-вирусных методов наиболее часточасто использован в ссылке на mammalian клетки, пока преобразование термине предпочтено описать non-вирусный переход дна в бактериях и non-animal eukaryotic клетках как грибки, водоросли и заводы.

Transfection животных клеток типично включает раскрыть переходные поры или «отверстия» в мембране плазмы клетки, для того чтобы позволить пониманию материала. Генетический материал (как supercoiled стройки дна или siRNA плазмиды), или даже протеины как антитела, могут быть transfected. В дополнение к electroporation, transfection может быть унесен путем смешивать катионоактивный липид с материалом для того чтобы произвести липосомы, которые сплавляют с мембраной плазмы клетки и депозируют их груз внутрь.

Первоначально смысль transfection была «инфекцией преобразованием», т.е. введение дна (или RNA) от вируса или бактериофага eukaryote в клетки, приводящ к в инфекции. Потому что преобразование термине имело другое чувство в животной биологии клетки (генетическом изменении позволяющ долгосрочному распространению в культуре, или приеме свойств типичных раковых клеток), transfection термине приобрел, для животных клеток, свою присутствующую смысль изменения в свойствах клетки причиненных введением дна.

Transfection метод которым экспириментально дна может быть положено в выращиванную в питательной среде: mammalian клетку. Такие эксперименты обычно выполнены используя клонированное дна содержа последовательности кодирвоания и зоны управления (промоутеры, etc) для того чтобы испытать будет выражено ли дна. В виду того что клонированное дна может обширно быть доработано (например, связующие сайты протеина на промоутере могут быть изменены или извлеканы), transfection часто использован для того чтобы испытать влияет на ли определенное изменение функцию гена.

Диаграмма Transfection:

Применения Transfection

Способность синтезировать RNA в лаборатории критическая к много методов. Radiolabeled и non-radiolabeled зонды RNA необходимы для много протоколов, и их можно синтезировать легко в малом масштабе в реакциях транскрипции vitro позволяющ их пользе в гибридизациях помаркой и assays предохранения от нуклеиназы.

• Вектор или дна
• Клетки
• Реагент Transfection

В vitro транскрипция требует очищенного линейного шаблона дна содержа промоутер, triphosphates рибонуклеотида, систему буфера которая включает DTT и магний

В vitro транскрипция требует очищенного линейного шаблона дна содержа промоутер, triphosphates рибонуклеотида, систему буфера которая включает DTT и магний

Методы Transfection

Различные методы вводить чужое дна в eukaryotic клетку. Много материалов были использованы как несущие для transfection, который можно разделить в 3 вида: (катионоактивные) полимеры, липосомы и nanoparticles.

Один из самых дешевых (и наименьшие надежные) методов transfection фосфорнокислым кальцием, первоначально открынным L. Graham и A.J. фургоном der Eb F. в 1973 [нужная цитация] (см. также [1]). HEPES-амортизированное saline разрешение (HeBS) содержа ионы фосфата совмещено при разрешение хлорида кальция содержа дна, котор нужно transfected. Когда 2 будут совмещены, точный преципитат кальция положительно заряженный и фосфата отрицательно заряженный сформирует, связывающ дна, котор нужно transfected на своей поверхности. Подвес преципитата после этого добавлен к клеткам, котор нужно transfected (обычно культура клетки, котор росли в монослое). не полностью понятым процессом, клетки принимают вверх некоторое преципитата, и с им, дна.

Другие методы используют высоки разветвлянные органические смеси, так называемые dendrimers, для того чтобы связать дна и получить его в клетку. Очень эффективный метод включение дна, котор нужно transfected в липосомах, т.е. малых, мембран-прыгнутых телах которые в некоторых путях подобных к структуре клетки и могут фактически сплавить с мембраной клетки, выпуская дна в клетку. Для eukaryotic клеток, основанный липид-катион transfection более типично использован, потому что клетки более чувствительны.

Другой метод польза катионоактивных полимеров как DEAE-декстран или polyethylenimine. Дна отрицательно заряженный связывает к polycation и комплекс принят вверх клеткой через endocytosis.

Сразу подход к transfection пушка гена, где дна соединено к nanoparticle инертного твердого тела (обыкновенно золота) которое после этого «снято» сразу в ядро клетки цели. Дна можно также ввести в клетки используя вирусы как несущая. В такие случаи, метод вызван вирусным transduction, и, сказаны, что transduced клетки.

Другие методы transfection включают nucleofection, electroporation, удар жары, magnetofection и собственнические реагенты transfection как Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene или DreamFect.

Конюшня против переходных методов Transfection

Для большинств применений transfection, достаточно если transfected ген только преходяще выражен. В виду того что дна введенное в процессе transfection обычно не введено в ядерный геном, чужое дна потеряно на более поздняя стадия когда клетки проходят митоз. Если пожелано, то что transfected ген фактически остает в геноме клетки и своих клеток дочи, стабилизированный transfection должен произойти.

Для выполнения этого, другой ген co-transfected, который дает клетке некоторое преимущество выбора, как сопротивление к некоторому токсину. Некоторые (очень несколько) из transfected клеток, невзначай, введут чужой генетический материал в их геном. Если токсин, к которому ген co-transfected предлагает сопротивление, после этого добавлен к культуре клетки, то только те немногие клетки при чужие гены введенные в их геном будут пролиферировать, пока другие клетки умрут. После придавать это давление выбора на некоторое время, только клетки с стабилизированным transfection остают и могут культивироваться более далее.

Общий агент для стабилизированного transfection Geneticin, также известное как G418, которое токсин который может быть нейтрализован продуктом гена неомицина упорного.

В vitro транскрипция требует очищенного линейного шаблона дна содержа промоутер, triphosphates рибонуклеотида, систему буфера которая включает DTT и магний

Подсказки для Transfection

• Используйте иы АБС битор рНКазы всегда!
• Деньги сбережени с полимеразой RNA T7 фаговой: Клоны с биркой N-стержня His-6 имеющиеся. Если вы получаете этот клон, то вы можете очистить большое количество полимеразы T7 с высокорадиоактивным (ref: Он b, Rong m, Lyakhov d, Gartenstein h, Diaz g, Castagna r, ВЕС McAllister, Durbin RK. Протеин Expr Purif. 1997, 9, 142-151).
• Для того чтобы извлечь шаблон дна, используйте РНКаз-свободный DNAse. Мы используем добавленный DNase RQ1 (Promega) на 15 минут и оно работает наилучшим образом. 

Хранить реагент Trasfection

• RNA наиболее наилучшим образомнаилучшим образом хранится на нейтральном пэ-аше с ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРАЦЕТАТОМ.
• Порекомендован буфер TE (Tris-HCl 10 mM, пэ-аш 7.5, ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРАЦЕТАТ 1 mM), тем ме менее это должно быть подготовлено при свободно очищенная рНКаза (preferablly вода Millipore).

Проблемы Transfection Troubleshooting

Неудачные Transfections

• Старый реагент transfection
• Неправильно, котор хранят агент transfection
• Дна низкого качества или вектор
• Недостаточное количество дна
• Недостаточный реагент transfection
• Слишком много дна
• Слишком много реагента transfection

Справки на Transfection

Справки на Transfection

1. Bacchetti s, Graham F (1977). «Переход гена для киназы тимидина к клеткам тимидина киназ-недостаточным людским очищенным дна простоя герпеса вирусным». Proc национальное Acad Sci США 74 (4): 1590-4. PMID 193108.