Добро пожаловать к молекулярной станции!

Вы должны зарегистрировать прежде чем вы можете вывесить на наши форумы или использовать наши предварительные характеристики. Регистр Теперь! Свои свободно и быстро!

Уже зарегистрировано? Login теперь ниже.

Уже зарегистрировано и забыл ваш пароль? Click ниже, котор нужно взять его.

Возьмите Lost Пароль

Соедините теперь - он быстрый и свободно!

Молекулярной станцией будет самая большая сеть исследователей, научных работников и любовников науки где-либо!

Молекулярная Биология - Quotes Науки

Большие люди науки будут высшими художниками. ~Martin H Фисчюер

Молекулярный Информационый бюллетень Биологии!

Недавние Столбы Форума

Изоляция RNA

Основная информация Извлечения RNA

Получающ высокое качество, неповрежденный RNA первое и часто больше всего критическийа шаг в выполнять много основная молекулярная биология экспериментирует, включая северный анализ, assays предохранения от нуклеиназы, RT-PCR, RNA составляя карту, in vitro перевод и архив ДНАА конструкция. Быть успешно, однако, процедура по изоляции RNA должен включить некоторые важные шаги оба before and after фактическое очищение RNA.

Основные Методы Изоляции RNA

В зависимости от RNA, котор нужно извлечь, будут свойства RNA которые позволяют его быть изолированным прочь от других клетчатых материалов such as протеины, ДНАО и даже липиды.

RNA или mRNA посыльного содержат выпарки аденозина простирания in the form of кабель poly(A). Это было эксплуатировано для того чтобы позволить mRNA быть прыгнутым к колонкам или шарикам сродства poly(T).

Концы для извлечения и изоляции RNA

Если вы в настоящее время имеете предпочитаемый метод для изолировать RNA, то продолжайтесь использовать его.

Если вы не изолировали RNA от вашей системы, то прежде чем и ваш организм не находится на following списке, мы можем помочь вам определить установленные протоколы которые были использованы для изолировать RNA для северный blotting или RT-PCR от вашей системы. Эти типы протоколов также произведут RNA "мичроарраы-stepeni".

Всегда бегите гель агарозы вашего RNA для того чтобы определить качество.

ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете non основанный колонкой реагент очищения such as TRIzol, котор мы рекомендуем вас осаждаем ваш RNA второе время от этанола или вы пропускаете его через колонку Rneasy или подобное приспособление. Это обеспечивает удаление всех органических загрязняющьих елементов (см. спектры ниже).

Иы АБС битор рНКазы используемые в извлечении и изоляции RNA

Проверять качество и количество изоляции RNA

Эффективная фракционировка nuclear/cytoplasmic может быстро быть определена путем денатурируя анализ геля агарозы (см. рисунок 1). Полосы соответствуя к rRNA прекурсора должны быть соответствующи в полной и ядерной части RNA. Полосы rRNA 18S и 28S будут более менее интенсивны в ядерной части RNA чем в или RNA итога или цитоплазменном RNA части. В некоторых линиях клетки, например 293 и клетках COS-7, эта разница будет драматически, но в других линиях клеток such as heLa клетки, полосы rRNA только небольш более менее интенсивны в ядерном RNA чем в полном или цитоплазменном RNA части."

Очищенность RNA

Чтения A260 и 260/280 коэффициентов не достаточно для того чтобы обеспечить RNA высокой очищенности. Вы должны принять польностью UV спектр. Под 3 спектра примера все имеют хорошее 260/280 коэффициентов, но имеют очень по-разному очищенности. Вы можете также использовать коэффициент 260/230 к помощи обусловливаете количество органического загрязнения в вашем RNA. Будет очень более переменным номером чем коэффициент 260/280, но вообще, коэффициенты над 1 показывают хорошую очищенность.

Квантифицировать извлечение и изоляцию RNA

Изоляция RNA от субцеллюлярных частей

Клетки после этого были помыты в PBS и последовательно извлекли как описано. Во первых, клетки были извлечены с буфером Nonidet P-40 (10 миллиметрами Трис-tris-Cl, (pH 7.5), 10 миллиметрами naCl, 3 миллиметрами mgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 миллиметр DTT). Остальная лепешка (грубый эндоплазменный ретикулум (RER) и ядро) была помыта в таком же буфере и извлечена в буфере б (10 миллиметрах Трис-tris-Cl (pH 7.5), 10 миллиметрах naCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРАЦЕТАТЕ 40 миллиметров, 40 units/ml Rnasin, 1 миллиметре DTT). Остальная ядерная лепешка была помыта в таком же буфере и извлечена с высоким буфером соли (10 миллиметрами Трис-tris-Cl (pH 7.5), naCl 0.5 м, 3 миллиметрами mgCl2, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 миллиметром DTT). RNA был очищен от каждой части разрешением stat RNA. Был изолирован полный RNA использующ реагент RNA-STAT60 (Телефон-ispytanie) согласно инструкциям предусмотренным изготовлением. (справка: Byeong-Churl Jang et al., 2002)

Изоляция RNA Использующ Протокол CsCl

Буфер беспорядка для изоляции RNA

На 100 mls 200 mls

4. ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРАЦЕТАТ 0.5M г 106.4 2% N-lauroylsarcosine тиоцианата 53.2 5M Guanidinium (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM 10 mls 20 mls 25mM Tris-HCl, mls 1M 2.5 pH 7.5 5 mls

0. б-merkapto3tanol 700ul 1.4mls 1M

0. пеногаситель а 2% (сигма) 200 ul ul 400

5. валик 7 м CsCl * окончательный том 100 ml

5. 7 М "Испеченное" CsCl 95.8g

0. ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРАЦЕТАТ 0.5M 1M 20 mls

Процедура по Извлечения RNA Использующ CsCl

* Используйте воду обработанную DEPC и испеченное стеклоизделие. Этим разрешением, совершенно, положительн должно быть рНКаза свободно. РНКаза везде! Несите перчатки, стеклоизделие пользы только испеченное, или виргинскую пластмассу. Обслуживание DePC ваша вода, буфера (за исключением Tris). Будьте очень тщательн.

1. Весьте животное. Извлекайте орган (печенку), утяжельте один из главных атрибутов ДНАА будет вами уменьшите сложность гена путем выбирать орган который только выражает одиночный локус энзима multilocus. 2. Гомогенизируйте ткань быстро в буфере "беспорядка" (9mls) 3. Закрутите homogenant на 12 килограммах для того чтобы извлечь неразрешимый материал 4. ПОКА Homogenant ЗАКРУЧИВАЕТ 4ЈA. Weight out 1.8 г из CsCl (0.2g/ml) в образец. 4B. В пробке ультрацентрифуги ("быстро-uplotnenii") добавьте 3.5mls 5.7M CsCl "валик" этот, котор слой должен быть рНКаза свободно. Вы центрифугуете ваш RNA через этот слой и любое загрязнение причинит значительно потери. 5. Извлекайте supernant, положено в свежую пробку, добавьте 1.8 г CsCl 6. Тщательно, добавьте homogenant on top of валик CsCl. Это само готово accomplished путем использование шприца 10cc и длинней иглы. Установьте needle/syringe в пробку быстро-uplotneni4, и добавьте ткань homogenant к шприцу. Homogenant медленно trickle в пробку Q-S, плавая on top of валик.

7. Тщательно, баланс сопрягал пары пробки центробежки (+-0.00щ г).

8. Пробки уплотнения, место сопрягали противоположность пробок себя и крышки с красными алюминиевыми верхними частями.

9. Центробежка, 50.000 rpms 5.5 часа, 20oC

После центрифугирования: Маркируйте пробки где лепешка должна быть: на нижней наружной стороне (по отношению к центру ротора)

10. Извлекайте пробки, установьте в удобном шкафе.

11. Отрежьте с верхней части tube.Aspirate с верхнее 2/3- 3/4 из разрешения. РАБОТАЙТЕ ОТ ВЕРХНЕЙ ЧАСТИ ВНИЗ. ВАЖНО ЧТО ВЫ АСПИРИРУЕТЕ С ВЕРХУШКЫ БОЛЬШИНСТВ РАЗРЕШЕНИЕ СПЕРВА И ИЗВЛЕКАЕТЕ ВСЕ НО ЯСНЫЙ ВАЛИК. НЕ АСПИРИРУЙТЕ НЕЗРИМУЮ ЛЕПЕШКУ НА ДНЕ.

12. Cut off верхнее 2/3 из пробки. Использующ "вытягиванное" Pasteur накапайте из пипетки, тщательно извлекайте остальное разрешение. Лепешка находится на дн-storone пробки.

13. Прополощите лепешку с 70% EtOH, извлекайте (польза Pasteur капает из пипетки), повторите дважды (итог 3 моет)

14. Добавьте ul 200 0.1x TE (рНКазы свободно), использование накапайте конец из пипетки для того чтобы задавить лепешку и "титровать" попытку T.E. положить лепешку в разрешение. По крайней мере сформируйте несродное разрешение и положите в свежую пробку microfuge.

15. Повторите с ul 200 T.E. складывая оба разрешения вместе

16. Вортекс, хороший RNA не любит пойти в разрешение. Терпением будет добродетель.

17. Обусловьте концентрацию, ul 10 в ul 490 (500 VOL ul окончательных)

18. Извлекайте от 1 до 2 ug RNA для анализа геля (добавьте буфера нагрузки RNA)

19. Добавьте рНКазу свободно 3M NaOAC 1/10 томов (ul 40), 2.5 тома EtOH (1.0ml). Смешивание ядрено.

20. Вы можете высчитать концентрацию RNA в EtOH.Thus, там будете никакой потребностью осадить весь из вашего RNA сразу. Как раз извлекайте около от 1.5 до 2 времени количество, котор вы путем vortexing разрешение EtOH/RNA и извлекайте соотвествующий том. Это разрешение EtOH/RNA, котор хранят на 20oC или понижает, стабилизировано на леты.

См.: