Спонсируйте/Разрекламируйте & Соедините к нам & Свяжитесь мы & О нас & Помогите нам

Молекулярная Биология Blog

Недавние Столбы Форума

 

Северная Помарка

Авторское право 2007 - Молекулярная Станция

ТОНАЛЬНОЗВУКОВО Слушайте к детальному северному объяснению помаркой!

История северный blotting

Северным blotting будет метод RNA blotting был начат в 1977 Алшине et al. на университете stanford (ref:1). Оно было назван после южного метода помаркой blots для ДНАА, изобретенного Edwin M Южн в 1975. Западной помаркой, метод для blotting для протеинов будет также игра на южной помарке называя и была названа в 1981 (ref:2).

Основная информация - Северный Метод Помаркой

Северный анализ несмотря на свое время в мире высокой технологии реального времени PCR, assays предохранения от нуклеиназы (RPAs) и microarrays, все еще золот-standartnymi для обнаружения и quantitation уровней mRNA. Это потому что северный анализ помаркой позволяет сразу сравнение обилия RNA посыльного между образцами на одиночной мембране.

В северной помарке главным образом разница между другими blotting методами что RNA будет будучи обнаруживанным фактором. Также, должно к факту что RNA обычно одиночн-sadits4 на мель, он создает сложные вторичные структуры которые влияют на свое переселение и следовательно денатурирующ условия используйте для того чтобы побежать гели (не похоже на южной).

RNA отделен вне электрофорезом геля RNA (обычно электрофорезом геля агарозы), затем переходом к мембране, гибридизацией с зондом, и окончательно обнаружением.

 

 

Подобно к южный blotting, зондами гибридизации могут быть ДНАОМ или RNA в северный blotting.

Вариант процедуры известной как обратная северная помарка случайн (хотя, нечасто) был использован. В этой процедуре, субстрат нуклеиновая, котор кислота (который прикреплен к мембране) будет собранием изолированных частей ДНАА, и зондом будет радиоактивно обозначенным RNA извлеченным от ткани и.

Польза microarrays ДНАА come into widespread польза in the late й990с и предыдущее 2000s более сродна к обратной процедуре, в что они включает пользу изолированных частей ДНАА прикрепленных к субстрату, и гибридизации при зонд сделанный от клетчатого RNA. Таким образом обратная включенная процедура, хотя первоначально неупотребительно, изучению одн-на-$$$-VREMENI выражения гена использующ северный анализ для того чтобы эволюционировать в выражение гена профилируя, в котором много (по возможности все) из генов в организме могут иметь их выражение контролировала

Применения северной помарки

Северные помарки superceded в большинств областях Реальн Временем PCR и microarray подходами. Она часто не использована для клинических или диагностических целей.

Северный протокол помаркой и свои изменения использованы однако в молекулярном исследовании биологии:

• золот-standartnoe для сразу изучения выражения гена на уровне mRNA (транскриптов RNA посыльного).
• обнаружение размера транскрипта mRNA
• ухудшение RNA изучения
• соединять RNA изучения - смогите обнаружить друг соединенные транскрипты
• изучьте полувыведение RNA
• изучение IRES (внутренне ribosomal место входа) - извлечь возможность пищеварения RNA против 2-ого перевода cistron.
• часто использовал подтвердить и проверить мышей transgenic/vykolotki (животных)

Недостатки северный blotting

Недостатки использования северный blotting вклюают:

• Часто радиоактивность использована. Это предотвращает легкость выполнять ее, пользу и избавление. Были произведены новые методы нерадиоактивного обнаружения позволяющ нерадиоактивное обнаружение. См. Для того чтобы Проколоть.
• Весь процесс северный blotting принимает длиннее время обычно, от подготовки образца до конца к обнаружению.
• Если образцы RNA ровными небольш ухудшенные РНасес, то качество данных и quantitation выражения довольно отрицательно affected.
• Стандартный северный метод помаркой относительно более менее чувствительн чем assays предохранения от нуклеиназы и RT-PCR. Чувствительность северных помарок может быть увеличена с пользой nylon положительн-porucennyx мембран, пользой высоки специфически зонда antisense.
• Обнаружением с множественными зондами будет проблема. Часто, мембраны необходимо раздеть перед гибридизацией и обнаружением с вторым зондом. Это будет проблема по мере того как необходимы, что strip зонды от помарки и жестковатые условия также уничтожать времени. Также, будет предел к количеству времен, котор помарка может быть раздета.

Преимущества северный blotting

Преимущества северных помарок вклюают:

• Будет широко принятым и наилучшим образом сосчитанным методом
• северным blotting будет прямодушный метод
• Часто оно использован как подтверждение или проверка
• Часто золот-standartnoe
• будет разносторонним протоколом по мере того как он может позволить использование много типов вклюать зондов (против реального времени PCR): radiolabeled и нон-non-radiolabeled, in vitro транскрибированный RNA и даже олигонуклеотиды such as праймеры.
• Последовательности с даже частично гомологичностью, не похоже на реальному времени PCR или другим методам можно использовать как зонды гибридизации (т.е. последовательность от по-разному вида для анализа гомологичности, or even genomic части можно использовать).

Северный Протокол Помаркой

По мере того как после того как я упомянуты шаги в северный blotting вклюают:

1. Изоляция RNA
2. Электрофорез геля RNA для разъединения
3. Переход к мембране (обычно положительн порученный нейлон как RNA отрицательно поручен)
4. Cross-linking RNA к мембране (обычно путем середины УВ-uV-crosslinking или химиката)
5. Гибридизация
6. Обнаружение

Материалы для северного протокола помаркой

Recipes Буфера

20XSSPE (500 ml)

• naCl 3.6M: 105.2 г
• 0. буфер фосфата pH 2M 7.0: 100mL 1M
• ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРАЦЕТАТ 20mM: 20mL 0.5M

Буфер фосфата pH7.0 (500ml)

• NaH2PO4 (одноосновные) 140 mL 1M
• Na2H2PO4 (двухосновные) 360 mL 1M
• pH до 7.0 после обоих добавлен

Буфер гибридизации = HB (100mls)

• 5X SSPE: 25mls 20X
• 2% sds: 20 mls 10%

 

* * Право перед использованием добавьте денатурированный 1000ug RNA дрождей 5000ug ДНАА рНКазы свободно CT (жары к 95Јo на 3 минуты, котор нужно денатурировать)

 

МЫТЬЕ: 2X SSPE + 0.1% sds (500 mls) 50 mls mls 20X 5 10% sds = 0.1% sds

Идущий буфер для геля RNA (1L)

• 100 mls 10X MOPS
• 52. 6 mls формальдегида
• 847. 4 mls H20

Гель RNA (70ml)

• 0.84 агарозы г
• 7 mls 10x MOPS
• 58.38 mls H2ЈO
• Положите гель в разрешение топлением. Препятствуйте гелю холодному к 60°C, после этого добавляйте формальдегид к равному 0.66M -- 3.78 mls
• Полейте гель в клобуке перегара если по возможности

Образцы RNA для северной помарки

См. изоляцию и очищение RNA

Гель RNA

После изолировать RNA, RNA необходимо отделить вне на геле (обычно агарозе).

см. гели RNA

Северный переход помаркой к nylon протоколу мембраны

После бежать гель RNA, помойте гель при distilled water одетое в posiblotter.

Слои от верхней части к дну являются следующими:

• губка
• 3-4 отрезок бумаг Whatman к размеру (both of these поднимающие вверх вышеуказанные должны быть выдержаны в 10X SSPE но не капать)
• маска геля.
• Примечание: Make sure верхние слои геля маска так, что она сможет загерметизировать мембрану с линией верхней части геля и правый верхний угол маркировал 3 части небольш более большой 3M бумажной трудной пластмассы с отверстиями

Струбцина дальше и make sure будет хорошее уплотнение. Используйте 75-80 ммий рт. ст. давления для 1 часа или больше.

Blot мембрана сухая

Мембраны Cross-linking Nylon - Северный Протокол Помаркой

• Отрежьте верхний wrap правого угла в wrap сарана.
• UV облучите с стороной RNA вниз на 2.5 минуты.
• Помойте для пары минут в горячем разрешении 2X SSPE/0.1% sds (разрешении микроволны на 30-45 секунд на силе 50%.
• Проветрите сухое

Pre гибридизация для северной помарки

1. Pre гибридизируйте на 6 casov-vsh ночь
2. Установите печь к 65°C буферу жары HB для того чтобы положить sds в разрешение
3. Сверните вверх мембрану внутри части сетки и положите в hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS)
4. Проверите для воздушных пузыреков
5. Положите пробку в печь сбалансированную с другой пробкой на противоположную сторону

Обозначая зонд для северный blotting

1. Положите 25ng зонда в полное давление 11uL с ddH2ЈO
2. Денатурируйте @ 95°C 3 минуты. Это должна получить зонду одиночно садить на мель и извлечь вторичную структуру предотвратила бы эффективную гибридизацию.
3. Быстро охладьте на влажном льде. Это должна держать садить на мель зонда одиночно, свободно вторичной структуры и не позволять reannealing (или реформировать вторичных структур).
4. Добавьте итог высоко основной (Boehringer mannheim) 5Јul альфаы 4Јul radiolabeled P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul
5. Инкубируйте 10-15 минимальных 37°C
6. Добавьте 28uL 1X TE, ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРАЦЕТАТА 2Јul 0.5M, к реакции 20ul.
7. Пре-zakrutite колонку G-25 sephadex на 1 минута.
8. Добавьте образец 50ul к колонке и закрутите на 2.5 минуты в клинической центробежке. Это должна очистить зонд прочь от ярлыка.
9. Хода колонка прочь.
10. Смешайте в новом RNA дрождей пробки 100ug CT-DNA 50ug в пробке 0.5mL.
11. Денатурируйте 95° 3 минуты
12. Добавьте к гибридному смешиванию пробки, гибридизируйте на 65°C на 20-36 часов

Вывесьте протокол гибридизации для северный blotting

Гибридизируйте на 36-48 часов после этого помойте.

1. Нагрейте вверх по жаре 2X SSPE/0.1% sds (мытье) до 65° ч (ванна микроволны или воды пользы для того чтобы греть разрешение)
2. Примите вне пробку и полейте жидкость в горячий контейнер радиоактивные отходы.
3. Rinse с мытьем 10ml делает это дважды и льет отход вне.
4. Положено в от 40 до 50 mls мытья и shake vigoursly.
5. Положено в печь гибридизации для минимальный вращать 20.
6. Полейте вниз с раковины
7. Другие 40-50mls и shake в печи.
8. Полейте вне к неныжному контейнеру (раковине if not горячей или токсической) и make sure он no longer горяч и после этого принимает вне мембрану.
9. Помойте на трасучке с 0.2XSSPE с 0.1% sds на rt на 15 минут.
10. Проветрите сухое
11. Публично разоблачение

 

Концы для северной помарки

Если вы в настоящее время имеете предпочитаемый метод для изолировать RNA, то продолжайтесь использовать его.

Всегда бегите гель агарозы вашего RNA для того чтобы определить качество. Not only положитесь на результатах спектрофотометрирования.

* Используйте воду обработанную DEPC и испеченное стеклоизделие. Этим разрешением, совершенно, положительн должно быть рНКаза свободно. РНКаза везде! Несите перчатки, стеклоизделие пользы только испеченное, или виргинскую пластмассу. Обслуживание DePC ваша вода, буфера (за исключением Tris). Будьте очень тщательн.

 

Устраняя неисправность Северные Помарки

Если вы в настоящее время имеете предпочитаемый метод для изолировать RNA, то продолжайтесь использовать его.

 

Обсудите и вывесьте вопросы о этом в северном форуме помаркой.

Северные Справки Помаркой

1. Alwine JC, Kemp DJ, Штарковское ГР (1977). "метод для обнаружения специфически RNAs в агарозе gels переходом к диазобензылохыметюыл-bumage и гибридизация с ДНАОМ зондирует". Proc. Natl. Acad. Sci. США. 74 (12): 5350-4.
2. W Неал Бурнетте (1981 -го Апрель). "' западный blotting ': электрофорезный переход протеинов от гелей полиакриламида додецилового — сульфата натрия к unmodified нитроцеллюлозе и радиографического обнаружения с антителом и radioiodinated протеин а ". Заднепроходный Biochem 112 (2): 195-203.