Спонсируйте/Разрекламируйте & Соедините к нам & Свяжитесь мы & О нас & Помогите нам

Молекулярная Биология Blog

Недавние Столбы Форума

 

2-D Габаритный Электрофорез Геля 2

Габаритным также вызванным электрофорезом геля 2 (сокращено как 2-D электрофорез или 2-DE) будет методом электрофореза геля общ использован для того чтобы отделить или проанализировать очень подобную в размере, и также много протеинов such as полный комплект протеинов присытствыющих в, котор дали времени клетки сразу, proteome.

2-D электрофорез геля отделяет протеины в 2 размерах, изоэлектрическом пункте и массе. Это позволяет разъединение протеинов в противном случае не смогли быть отделены или различены на гелях 1-D, включая подобно определенные размер протеины и много протеинов (such as proteome).

2-D Содержание геля

• 2-D Предпосылка Электрофореза Геля
• 2-D Статьи Геля
• Разъединение Изоэлектрическ Пунктом
• 2 Метода Габаритных Электрофореза Геля Пятная
• 2-D Протокол Электрофореза Геля
• Другие 2-D Протоколы Электрофореза Геля
• Устраняя неисправность 2-D Гели
• 2-D Форум электрофореза геля (вы можете спросить любой вопрос о 2-D здесь! Также соедините пересылая список для того чтобы получить до вопросов о и ответов дня на 2-D гелях от других исследователей и специалистов науки!)

Габаритная Предпосылка Электрофореза Геля 2

Электрофорез всех клетчатых протеинов через СДС-gel6 может отделить протеины имея относительно большие разницы в молекулярном весе однако, оно не может готово разрешить протеины имея подобные весы (например протеин 53-kDA от протеина 52-kDA).

В методе электрофореза геля 1D, протеины отделены в одним размером (который будет они отделен массой только).

В 2-D электрофорезе, разъединением начинает с электрофорезом 1-D однако там будет второе разъединение которое принимает место, отделяя протеины обязанностью в направлении 90 градусов от первого.

Результат что analytes распространены вне через габаритную поверхность 2 rather than вдоль линии. Таким образом, должно к факту что протеины отделены not only массовым но также обязанностью, маловероятно что будет больше чем один протеин на одном, котор дали пятно на 2-D геле. Это потому что маловероятно что 2 протеина делили not only такую же точно массу но также эти же обязанность.

Поэтому, на 2-D геле, analytes эффективно отделены в 2-D электрофорезе чем в электрофорезе 1-D должном к второму шагу разъединения обязанностью.

2-D метод разъединения геля Изоэлектрическ Пунктом

Для того чтобы отделить протеины подобной массы, другую физическую характеристику протеинов необходимо использовать. Другим важным физическим свойством протеина может быть использовано в разъединении будет плата за электроэнергию, которая обусловлена числом кислотных и основных выпарок в протеине и их обязанности группы.

2 unrelated протеина имея подобные массы маловероятны для того чтобы иметь идентичные сетчатые обязанности потому что их последовательность amino acid была бы друг, и таким образом обязанность и число кислотных и основных выпарок дали бы по-разному сетчатую обязанность. Это позволило бы эти протеины быть отделенным 2-D, но не электрофорезом геля 1-D.

В 2-D методе разъединения геля, протеины фактическ отделены изоэлектрическим пунктом (изоэлектрическим пунктом (pI) будет pH на который определенные молекула или поверхность не носят никакую сетчатую плату за электроэнергию).

Градиент pH приложен к гелю и электрический потенциал приложен через гель, делая один конец более положительной чем другое. На всем aother pHs чем их изоэлектрический пункт, будут поручены протеины. Если они положительн поручены, то они будут вытягиваны к более отрицательному концу геля и если они отрицательно поручены, то они будут вытягиваны к более положительному концу геля. Как только они достигают зону геля при pH соответствуя к их изоэлектрическому пункту, однако, они станут neutraly порученными и останут в том пятне.

2-D Методы Электрофореза Геля Пятная

Протоколы обнаружения протеина для габаритного электрофореза 2

После разъединения, протеины отделены вне на 2-D геле, как бы незримы к нагому глазу. Для того чтобы визуализировать протеины на геле, очень чувствительные методы пятнать и обнаружения протеинов необходимо снести вне.

Это должно к нескольким фактов:

1. Майны геля могут только признавать некоторый том lysate клетки или разрешения протеина.
2. Хотя lysate/solution можно осадить и сконцентрировать для того чтобы нагрузить больше протеина, обычно меньше протеин нагружен на 2D геле по мере того как чрезмерно количество протеина делает его трудным проанализировать гель должный к большим размерам пятна.
3. Разъединение большого количества протеина (mgs), or even тысячи по-разному протеинов от одной малой майны, в относительно большой гель dimensionsional 2 производят пятна протеинов которые будут очень низкими abudance/konqentraqie1 (ng или picograms!) то невозможно или трудно для того чтобы обнаружить обычными пятнами или методами обнаружения протеина.
4. Низкое обилие/низко копирует протеин номера можно отделить, но не может даже быть обнаруженные должными к факту что самые чувствительные пятна только имеют предел обнаружения около 1/2 nanogram. Уровни пятна Picogram в настоящее время очень трудны или невозможны для того чтобы обнаружить с пятнать.

В 2D электрофорезе, очень чувствительные пятна поэтому необходимы. Эти протеины могут после этого быть обнаружены разнообразием середин, но самое общее будет пятно пятнать и coomasie серебра.

Серебряные Пятная 2D Гели

В пятнать 2-D геля серебряный, серебряный коллоид приложен к гелю. Серебр скрепляет к группам цистеина внутри протеин. Серебр после этого затмлен подвержением к ультрафиолетовому свету. Темнота серебра в пятне, можно отнести к количеству серебра и поэтому количеству протеина на, котор дали положении на геле. Эта чонсервная банка измерения только дает приблизительное количество, но подходящя для большинств целей.

Пятнать Coomasie 2D гелей

Краска Coomassie связывает к протеинам через physisorption к амино кислотам such as ароматичные амино кислоты, аргинин, и гистидин. Coomasie также использовано в методе bradford. Чувствительные нетоксические пятна coomasie были произведены позволяют визуализирование пятен содержа меньш чем 1 ng протеина.

Пятнать SYPRO 2D гелей

РУБИН SYPRO будет очень чувствительным 2D пятном метода обнаружения протеина, позволяющ визуализированию около 1/2 ng протеина на, котор дали пятне. Недостаток будет методом требует, что ультрафиолетовый свет визуализирует пятно, таким образом требующ использования ультрафиолетового света. Это делает вырезывание пятен трудное и потенциальн опасное должное к по возможности UV выдержке.

 

2-D Протокол Электрофореза Геля

Габаритный протокол электрофореза геля 2 для 7 сантиметров IPG раздевает воспринимать ge Amersham.

2D Подготовка Образца Геля

• Образцы протеина обычно быть desalted или делали диализ. Диализ можно дирижировать с большими мешками диализа для больших томов, или миниые spolzaht-$$$-LYZER (проколите) для малых томов.
• Диализ был дирижирован с 1 л гидрокарбоната аммония 0.3mM над 30 минутами, котор использование spolzaet-$$$-LYZER наборы диализа (проколите).
• После диализа, были лиофилизованы образцы использующ lyophilizer для 1 ½ часы.
• Лиофилизованные образцы после этого воспроизвелись с 400 л буфером регидрации.

 

Фокусировать IEF Изоэлектрический

Раздел 1. Регидрация прокладок IPG

• Поднос регидрации drystrip isoelectrofocusing быть осторожным был очищен с разрешением чистки IPGphor (ge Amersham воспринимая).
• Make sure поднос сухие влажными, по мере того как образец проникнет вдоль каналов воды.
• Накапайте 125 л из пипетки на круговую зону подноса.
• Использующ щипчики, тщательно извлекайте прокладки IPG от пластичного протектора.
• Прокладки некоторого IPG имеют пластичное coversheet или strip защищающ сторону геля. Извлекайте эти используя корнцанг/щипчики перед использованием этих прокладок.
• Нежно lay down сторона геля прокладки вниз на образец.
• Извлекайте все пузыри.
• Lay down на конце масла майны подноса минерального и make sure вы нажим, котор он опускает майну до тех пор пока он вполне не покрыть прокладку IPG. Make sure верхние слои минерального масла прокладка целого по мере того как это предотвращает испарение во время регидрации шагают.

 

 

Proteomics Домашнее	Proteomic Протоколирует Молекулярная Станция	Протоколы Proteomic (внешние соединения)	Proteomic Bioinformatics	Faq Proteomic	Наборы и продукты Proteomic	Форум Proteomic	Proteomics Blog	Книги на Proteomics	Весточка Proteomic