Западная помарка

Теперь выучьте что все еще там о западных помарках!

- Образец Prepartation

- Лизировать буфер

- Антитело

- Лизировать клетки

- Подготовка геля

- Гель

- Переход геля

- Управление

- Западная помарка

- Отсчет

- Анализ и толкование

Имеете ли вы Non-адэрентные клетки (как линии T-cell или периферийные клетки крови) или адэрентные клетки (как клетки фиброцита или клетки COS), вам нужно извлечь extraneous протеины от средств. Для non-адэрентных клеток вы можете нежно pellet они с центрифугированием и после этого помыть лепешка с PBS. Для адэрентных клеток, просто мытья склянка или тарелки с PBS до западной помарки.

Западный анализ помаркой рассматривает протеины, и поэтому мы хотим протеины быть отпуском от клеток и также предотвращать протеины от быть отрезанным вверх протеазами. Нам нужны эти к западной помарке:

- держать вещи холодной! 4C на льде во время lysis клетки для западный blotting

- используйте тензид к замкнуть вулканизационный барабан мембраны клеток для того чтобы выпустить протеины

- Буфер

- Иы АБС битор (и иы АБС битор протеазы и иы АБС битор фосфатазы если мы сделаем западную помарку для фосфоропротеидов), то

Детержентно - лизировать клетки для западной помарки

SDS и RIPA тензиды которые использованы для того чтобы солюбилизировать протеины для более последнего анализа используя западный blotting. Это необходимо так много протеинам или внутри клетки или обнаруженных местонахождение внутренних мембран клетки, поэтому нам нужно выпустить эти протеины для того чтобы мочь к immunoblot для их.

Вы должны выбрать антитело для использования для западной помарки. Обычно или использованы антитела мыши моноклональные или антитела кролика polyclonal.

Вы можете использовать или антитело без всех добавленных групп, или используйте антитело которое проспрягано к биотину. Эти антитела не требуют

Polyclonal против моноклональных антител для западной помарки

Моноклональные антитела обычно более лучшие для западный Blotting должный к:

- более лучший отношение сигнал-шум (более низкая предпосылка в западной помарке)

- их более высокая характерность (вы получаете меньше загрязняясь протеины или Ig)

- общие результаты уборщика на западной blotting пленке (более менее неспецифичных обнаруженных диапазонах)

Polyclonal антитела более лучше одеты для иммунопреципитации:

- они узнают больше epitopes

- имейте более высокий avidity

ПОДСКАЗКИ перед вами лизируют для западный blotting:

Если вы идете к западной помарке для массы, то протеина (ie протеин который не phosphorylated):

- вы можете лизировать в более больших томах (держа остальные для того чтобы blot для других протеинов)

Если вы идете к западной помарке фосфоропротеид, то (или phosphorylated протеин) важно сделать следующее:

- убеждайтесь вы иы АБС битор фосфатазы пользы (как vanadate потому что фосфатазы извлечут фосфаты от ваших протеинов! )

- также лизируйте клетки в самом малом возможном томе (сделан ie лизирует в буфере нагрузки ul 100, этом потому что вы можете нагрузить большую часть из клеток вы лизировали. Это важно по мере того как сигнал довольно слаб когда западный blotting для фосфоропротеидов.)

Если вы смотрите взаимодействия протеин-протеина:, то

- не используйте SDS по мере того как он разъединяет взаимодействия протеин-протеина и таким образом протеины денатурированы (специально после кипеть)

- для западных blotting взаимодействий протеин-протеина, взаимодействий ie родних вы должны использовать менее-строгий тензид такое RIPA.

Лизировать:

- смогите быть сделано сразу на плите или тарелке

- pellet клетки

- Держите на льде и холоде - используйте ведро льда

- Эмпирический способ для насколько буфера lysis использовать: 10^5 клетки/uL буфера lysis

- соберите в пробках eppendorf и обозначьте (держите эти на льде)

Измерьте полное содержание белков перед западным анализом помаркой:

- это позволяет более количественному анализу если вы хотите сравнить условия обработки в западном анализе помаркой

- коммерчески наборы имеющиеся как assay Брадфорд для измерять полное содержание белков (от Био-Rad)

- 0.1% из SDS или большой могут помешать с измерением протеина

Денатурируйте образцы протеина:

- добавьте буфер образца нагрузки протеина к аликвоту lysate клетки - содержит краску (слишком см. переселение на геле, 2% SDS)

- добавьте разбавитель дисульфида как бета - меркаптоэтанол

- Чирей в воде - блок ванны или топления (более низкие температуры как среднее - 90 градусов уменьшает комплексирование протеина).

- Засуните отверстие в крышке каждой пробки для того чтобы предотвратить хлопнуть

Гели SDS-PAGE матрицы геля которые использованы для того чтобы отделить протеины размером в присутствии к электрическому току. Низкие гели процента отделяют более большие протеины тогда как более высокие гели процента отделяют более малые протеины более лучше. Проблема что все протеины имеют порученное связано с ими, и в электрическом течении это смогло причинить проблемы. Это разрешено добавлением SDS к образцам протеина. SDS связывает к протеинам каждые немногие аминокислоты и нейтрализует разницы в обязанности которые протеины имеют. Это позволяет протеинам быть отделенным размером и не обязанностью.

- в зависимости от насколько протеина вы будете хотеть нагрузить для западный blotting, вы должны использовать малые гребни или более большие гребни.

- процент акриламида важн. Акриламид обычно 10% использован.

- Разрешая гель использован на дне с пэ-ашем 8.8

- Штабелируя пэ-аш 6.8 геля (4-5%) использован для того чтобы упаковать протеины внутри совместно после нагружать

- Полимерность гелей увеличена катализаторами APS и TEMED которые быстро проходят вверх по реакции полимерности (образование и затвердевание) геля полиакриламида.

- Нагрузите каждый образец тщательно и медленно предотвратить образец протекая из майны.

- Нагрузите каждую майну и используйте буфер образца в каждом (предотвратить разницы внутри).

1. Центрифугуйте образцы на sec 10 после кипеть.
2. Нагрузите образец в каждую майну
3. Нагрузите справку MW
4. Побегите гель на 100V (постоянн напряжении тока) или даже лучше на 40 mA (постоянн течении). Наблюдайте отметку/трап протеина или красьте фронт для когда остановить гель. Постоянн течение дает более лучшие и более острые результаты если вы имеете время.

- вахта для пузырей между стеклом и под гелем - это значит что оно работает

- вахта для переселения протеина (идти вниз) - если не вы переключали руководства и можете потерять все ваши образцы!

- Первоначально побегите медленно через штабелируя гель (~ 50 вольтов), это дает более острые диапазоны.

- Не побегите всю ночь

- Не перегрейте гель (это причиняет гель потерять ригидность, водящ к бедным resoloving и расплывчатый плох сформированным диапазонам)

Выберите тип мембраны:

Смогите использовать то:

- Мембрана PVDF для западных помарок

- Мембрана нитроцеллюлозы для западных помарок

- Мембрана нейлона (редко используемая теперь - смогите сорвать)

Подсказки для переносить к западной мембране:

- Перчатки износа все время! Используйте корнцанг

- Уменьшите касатьться/корнцанг к мембране

Заказ перехода Био-RAD:

(-)
губка на черноте
фильтровальная бумага
нитроцеллюлоза геля
фильтровальная бумага
губка
(+)

Переход:

- Держите холодным в 4C

- Переход всю ночь на 35 v

- Смогите перенести быстро в 1 час на более высоком v

Преграждать мембран позволяет вам увеличить сигнал: коэффициент шума

- перчатки износа

- Блок с 5% Blotto (non-fat сухое молоко - порошок) или 1 до 5% BSA (альбумин Bovine сыворотки) для phosphorylated протеинов.

- Буфер TBST

Мыть после преграждать

- мыть после преграждать шаги не критический, по мере того как блок людей часто во время основных инкубаций антитела.

- запиток обычно сделан с буфером TBST. Смогите быть сделано быстро с большим томом TBST.

Инкубация с основным антителом

- мышь, кролик или другой вид

- обычно 1: разбавление 1000 с TBST

- если высокая предпосылка/много неспецифичных диапазонов проблема, то инкубации можно сделать с 5% BSA или молоко.

Мыть после основного антитела

- не настолько критическо

- смогите помыть быстро с большими томами TBST

Инкубация вторичного антитела

- обычно разбавляемое 1: 10, 000 с TBST

- anti-мышь, anti-кролик, или другое антитело проспряганное с энзимом HRP для обнаружения

Мыть после вторичного антитела

- КРИТИЧЕСКО

- Мытье 5 x на 5 минут с TBST.

- Если вы действительно должны поспешить, то помыть хотя бы 3 времени с более большими томами TBST.

Assaying для результатов

- обычно ECL (увеличенная хемолюминесценция) использован

- подвергается действию и начата пленка. Выдержка на 10 секунд обычно достаточно для полного содержания белков. Фосфоропротеиды могут требовать 2 до 20 мельчайших выдержек.

- пленка обычно XOMAT или подобная «быстрая» пленка

WB - западная помарка

IB - immunoblot (другая термина для западный blotting)

SDS - Сульфат натрия додециловый (тензид используемый в много западных blotting разрешений)

СТРАНИЦА - электрофорез геля Polyacrilamide

Ab - Антитело (антитела использованы для того чтобы обнаружить ваш протеин интереса)

HRP - Пероксидаза редиски лошади

Luminol - субстрат который HRP колет для того чтобы причинить светлому образованию

ECL - Увеличенная хемолюминесценция (западное разрешение помаркой которого увеличивает светлое образование от HRP + Luminol)

kD/kDa - kilodalton (большинств средний протеинов между kDa 30 до 80)

RAM - anti-мышь Ig кролика

Ig - иммуноглобулин (isotype антитела)

NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - фторид phenylmethylsulfonyl

BSA - Альбумин Bovine сыворотки

NFDM - Non-fat сухое молоко