Спонсируйте/Разрекламируйте & Соедините к нам & Свяжитесь мы & О нас & Помогите нам

Молекулярная Биология Blog

Недавние Столбы Форума

 

См. также: Родственные соединения к внешним местам: Западная Помарка

Западная Помарка

АУДИОИЙ: Слушайте к детальному западному объяснению помаркой! Учтивость: Национальный Людской Научно-исследовательскийа институт Генома.

Западное Определение Помаркой: Западным blotting будет метод используемый для того чтобы определить и обнаружить местонахождение протеины основанные на их способности связать к специфически антителам.

   Западный анализ помаркой может обнаружить ваш протеин интереса от смеси огромное количество протеинов.  Западный blotting может дать вам информацию о размере вашего протеина (с сравнением к отметке или трапу размера в kDa), и также дает вам информацию на выражении протеина (с сравнением к управлению such as untreated образец или другие тип или ткань клетки). 

Сводка: Западная помарка дает вам информацию на:

Размер вашего протеина

Количество выражения вашего протеина

Западный анализ помаркой может проанализировать любой образец протеина ли от клеток или тканей, но также смогите проанализировать рекомбинатные протеины синтезированные in vitro. Западная помарка зависит на качестве антитела, котор вы используете зондировать для вашего протеина интереса, и как специфический оно для этого протеина. Антитела теперь легко достижимы от коммерчески источников, и вы можете закупить одно для вашего протеина интереса. Если ваш протеин будет протеином романа, то вы себя должны произвести антитело или получить, что компанию сделали его для вас. In this case вы по крайней мере малое количество вашего протеина или очищенного от выдержек клетки или сделанного как рекомбинатное (ie in vitro или в рекомбинатной системе выражения протеина).   Антитела специфически к вашему протеину существены к западный blotting по мере того как они могут связать специфически к вашему протеину интереса вместо тысяч протеинов на вашей западной помарке!

Рисунок 1. Детали шагов, котор включили в получать протеин для западной помарки.

  Рисунок 2. Вычисляйте детализировать шаги в дирижировать западную помарку.

[верхняя часть]

Как Западный Blotting Работает?

См. диаграмму 1 ниже. Первые вещи первое. Получите образец протеина, котор вы хотите проанализировать, such as образцы клетки. Лизируйте клетки для того чтобы выпустить содержание протеина. Побегите эти на геле отделяет протеины on the basis of размер. После этого перенесите эти протеины геля на мембрану использующ электричество. Эту мембрану можно после этого использовать для того чтобы зондировать для протеинов интереса использующ главным образом антитело.

Вы западная помарка:

Образец Протеина

Хорошее антитело для того чтобы обнаружить ваш протеин интереса

Западная помарка полагается на главным образом антителе для того чтобы обнаружить этот протеин от тысяч протеинов на вашей мембране и ранее на вашем геле! (клетка может содержать 30.000 по-разному протеинов - и эти такие же протеины можно даже изменить дающ вас над 300.000 по-разному протеинами!). Использование антитела узнает ваше первичное антитело (вторичное антитело), котор вы build up сандвич протеин-антител-antitela!  Вторичное антитело имеет энзим пероксидазы редиски лошади преобразовывает субстрат luminol к светлому выпуская веществу! Этот свет обнаружен как пятно на пленке. От этого пятна вы можете обусловить how much протеина там по отношению к другим пятнам, или размер протеина по отношению к отметке размера которая бежится также на геле.

Диаграмма 2 показывает западный гель примера помаркой. Майну 1 будет трапом отметки размера протеина показывает по-разному знанные размеры протеинов, это можно закупить коммерчески и размеры всех пятен уступаны памфлет. Майна 3 будет образцом рака и майна 5 будет нормальнаяа выборка. По мере того как вы можете увидеть протеин в майне 3 имеет более высокое выражение чем образец рака в майне 5, которая интересна. Также, пятна протеина в майнах 3 и 5 будут таким же размером какой 2-ое пятно в трапе размера от майны 1. Мы можем после этого посмотреть знанный размер протеина от нашей брошюры мы получили с трапом. Мы после этого обусловливаем что размером протеина будет kDa 80. Наш протеин интереса будет также kDa 80. Так мы знаем что западная помарка работала и что протеин высоки выражен в образце рака!

Обнаружить ваш протеин:

Купите антитело против вашего главным образом источника антитела

Используйте ecl - набор и пленка хемолюминесценции для того чтобы получить результаты

[верхняя часть]

Диаграмма 1.                                                                                                                                      Диаграмма 2.

Теперь выучьте все еще там о западных помарках!

[верхняя часть]

Содержание, в заказе сделанном для западной помарки:

Шаги в западный blotting:

- подготовляющ для западной помарки

- антитело, котор нужно использовать для западных помарок

- лизировать клетки для западной помарки

- Данные по Геля SDS-PAGE

- подготовка геля SDS-PAGE для западных помарок

- электрофорез геля - бежать гель

- Tranfer протеинов к мембране для западный blotting

- Западная Помарка

Термины и определения используемые в западном анализе помаркой

Самые последние Западные Темы Помаркой!

 

[верхняя часть]

Шаги в западный анализ помаркой:

- Образец Prepartation

- Лизировать Буфер

- антитело

- Лизировать Клетки

- Подготовка Геля

- Гель

- переход геля

- управление

- Западная Помарка

- считывание

- анализ и толкование

[верхняя часть]

Подготовить образцы для западной помарки:

Имеете ли вы Нон-ad3rentnye клетки (such as линии Т-kletki или периферийные клетки крови) или адэрентные клетки (such as клетки фиброцита или клетки COS), вы извлечь extraneous протеины от средств. Для нон-ad3rentnyx клеток вы можете нежно pellet они с центрифугированием и после этого помыть лепешка с PBS. Для адэрентных клеток, просто мытья склянка или тарелки с PBS до западной помарки.

 

Западный анализ помаркой рассматривает протеины, и поэтому мы хотим протеины быть отпуском от клеток и также предотвращать протеины от быть отрезанным вверх протеазами. Мы эти к западной помарке:

- держать вещи холодной! 4C на льде во время lysis клетки для западный blotting

- используйте тензид для того чтобы сломать вверх мембраны клеток для того чтобы выпустить протеины

- буфер

- иы АБС битор (и иы АБС битор протеазы и иы АБС битор фосфатазы если мы сделаем западную помарку для фосфоропротеидов)

 

Детержентно - Лизировать Клетки Для Западной Помарки

Sds и RIPA будут тензиды использованы для того чтобы солюбилизировать протеины для более последнего анализа использующ западный blotting. Это необходимо так много протеинам или внутри клетки или обнаруженных местонахождение внутренних мембран клетки, поэтому мы выпустить эти протеины для того чтобы мочь к immunoblot для их.

[верхняя часть]

Которое антитело должен я использовать для западный blotting?

Вы должны выбрать антитело для использования для западной помарки. Обычно или использованы антитела мыши моноклональные или антитела polyclonal кролика.

Вы можете использовать или антитело без всех добавленных групп, или используйте антитело которое проспрягано к биотину. Эти антитела не требуют

 

Polyclonal против моноклональных антител для западной помарки

Моноклональные антитела обычно более лучшие для западный blotting должный к:

- более лучший коэффициент signal to noise (более низкая предпосылка в западной помарке)

- их более высокая характерность (вы получаете меньше загрязняясь протеины или Ig)

- общие результаты уборщика на западной blotting пленке (более менее неспецифичных обнаруженных полосах)

 

Антитела Polyclonal более лучше одеты для иммунопреципитации:

- они узнают больше epitopes

- имейте более высокое avidity

[верхняя часть]

Лизировать клетки для западной помарки:

КОНЦЫ перед вами лизируют для западный blotting:

Если вы идете к западной помарке для массы, то протеина (ie протеин не phosphorylated):

- вы можете лизировать в более больших томах (держа остальные для того чтобы blot для других протеинов)

 

Если вы идете к западной помарке фосфоропротеид, то (или phosphorylated протеин) важно сделать following:

- make sure вы иы АБС битор фосфатазы пользы (such as vanadate потому что фосфатазы извлечут фосфаты от ваших протеинов! )

- также лизируйте клетки в самом малом томе по возможности (сделан ie лизирует в буфере нагрузки ul 100, этом потому что вы можете нагрузить большую часть из клеток, котор вы лизировали. Это важно по мере того как сигнал довольно слаб когда западный blotting для фосфоропротеидов.)

 

Если вы смотрите взаимодействия протеин-proteina:, то

- не используйте sds по мере того как он разъединяет взаимодействия протеин-proteina и таким образом протеины денатурированы (специально после кипеть)

- для западных blotting взаимодействий протеин-proteina, взаимодействий ie родних вы должны использовать менее-less-stringent тензид такое RIPA.

 

Лизировать:

- смогите быть сделано сразу на плите или тарелке

- pellet клетки

- держите на льде и холоде - используйте ведро льда

- практический метод для how much буфера lysis использовать будет: клетки 10^5/$$ET-uL буфера lysis

- соберите в пробках и ярлыке eppendorf (держите эти на льде)

 

Измерьте полное содержание белков перед западным анализом помаркой:

- это позволяет более количественный анализ если вы хотите сравнить условия обработки в западном анализе помаркой

- коммерчески наборы имеющиеся such as assay bradford для измерять полное содержание белков (от Био-bio-Rad)

- 0.1% из sds или большой чонсервной банкы мешают с измерением протеина

 

Денатурируйте Образцы Протеина:

- добавьте буфер образца нагрузки протеина к аликвоту lysate клетки - содержит краску (слишком см. переселение на геле, 2% sds)

- добавьте разбавитель дисульфида such as бета - меркаптоэтанол

- чирей в ванне воды или блоке топления (более низких температурах such as mid - 90 градусов уменьшают комплексирование протеина).

- засуните отверстие в крышке каждой пробки для того чтобы предотвратить хлопнуть

 

Данные по геля SDS-PAGE для западный blotting

Гели SDS-PAGE будут матрицами геля использованы для того чтобы отделить протеины размером in the presence of электрическое течение. Низкие гели процента отделяют более большие протеины тогда как более высокие гели процента отделяют более малые протеины более лучше. Проблема что все протеины имеют порученное associated с ими, и в электрическом течении это смогло причинить проблемы. Это разрешено добавлением sds к образцам протеина. Sds связывает к протеинам каждые немногие амино кислоты и нейтрализует разницы в обязанности протеины имеют. Это позволяет протеины быть отделенным размером и не обязанностью.

[верхняя часть]

Подготовка геля SDS-PAGE для западной помарки

- в зависимости от how much протеина вы будете хотеть нагрузить для западный blotting, вы должны использовать малые гребни или более большие гребни.

- процент акриламида важн. Акриламид обычно 10% использован.

- разрешая гель использован на дне с pH 8.8

- штабелируя гель (4-5%) pH 6.8 использован для того чтобы упаковать протеины внутри совместно после нагружать

- полимерность гелей увеличена катализаторами aps и TEMED speed up реакция полимерности (образование и затвердевание) геля полиакриламида.

- нагрузите каждый образец тщательно и медленно предотвратить образец протекая из майны.

- нагрузите каждую майну и используйте буфер образца в каждом (предотвратить разницы внутри).

[верхняя часть]

Gel Электрофорез

1. Центрифугуйте образцы для 10 sec после кипеть.
2. Нагрузите образец в каждую майну
3. Нагрузите справку mw
4. Побегите гель на 100V (постоянн напряжении тока) or even улучшайте на 40 mA (постоянн течении). Наблюдайте протеин marker/ladder или красьте фронт для когда остановить гель. Постоянн течение дает более лучшие и более острые результаты если вы имеете время.

- вахта для пузырей между стеклом и под гелем - это намеревается что оно работает

- вахта для переселения протеина (идти вниз) - if not вы переключали руководства и можете потерять все ваши образцы!

- первоначально побегите медленно через штабелируя гель (~ 50 вольтов), это дает более острые полосы.

- не побегите всю ночь

- не перегрейте гель (это причиняет гель потерять ригидность, водящ к бедным resoloving и blurry плох сформированным полосам)

[верхняя часть]

Tranfer протеинов к мембране для западный blotting

Выберите Тип Мембраны:

Смогите использовать то:

- мембрана PVDF для западных помарок

- мембрана нитроцеллюлозы для западных помарок

- nylon мембрана (редк используемая теперь - смогите сорвать)

 

Концы для Transfering к западной мембране:

- перчатки износа все время! Используйте корнцанг

- уменьшейте touching/forceps к мембране

 

Заказ перехода Био-bio-RAD:

(-)
губка на черноте
фильтровальная бумага
нитроцеллюлоза геля
фильтровальная бумага
губка
(+)

Переход :

- держите холодным в 4C

- переход всю ночь на 35 в

- смогите перенести быстро в 1 час на более высоком в

[верхняя часть]

Западная Помарка

Преграждать мембран позволяет вас увеличить коэффициент signal:noise

- перчатки износа

- блок с 5% Blotto (non-fat сухое молоко - порошок) или от 1 до 5% BSA (альбумин сыворотки bovine) для phosphorylated протеинов.

- буфером будет TBST

Мыть После Преграждать

- мыть после преграждать шаги не критически, по мере того как блок людей часто во время главным образом инкубаций антитела.

- запиток обычно сделан с буфером TBST. Смогите быть сделано быстро с большим томом TBST.

Инкубация с главным образом антителом

- мышь, кролик или другой вид

- обычно 1: разбавление 1000 с TBST

- если высокие полосы background/many неспецифичные будут проблемой, то инкубации можно сделать с 5% BSA или молоко.

Мыть после главным образом антитела

- настолько критически

- смогите помыть быстро с большими томами TBST

Инкубация вторичного антитела

- обычно разбавляемое 1: 10. 000 с TBST

- анти-myw6, анти-krolik, или другое антитело проспряганное с энзимом HRP для обнаружения

Мыть После Вторичного Антитела

- КРИТИЧЕСКИ

- мытье 5 х на 5 минут с TBST.

- если вы реально должны поспешить, то помыть по крайней мере 3 времени с более большими томами TBST.

Assaying для результатов

- обычно ecl (увеличенная хемолюминесценция) использован

- подвергается действию и начинается пленка. Выдержка на 10 секунд обычно достаточно для полного содержания белков. Фосфоропротеиды могут требовать от 2 до 20 мельчайших выдержек.

- пленка будет обычно XOMAT или подобной ' быстрой ' пленкой

[верхняя часть]

См. Устраняя неисправность Западную Помарку

Термины используемые в западный blotting:

WB - западная помарка

IB - immunoblot (другая термина для западный blotting)

Sds - сульфат натрия додециловый (тензид используемый в много западных blotting разрешений)

СТРАНИЦА - Электрофорез Геля Polyacrilamide

Ab - антитело (антитела использованы для того чтобы обнаружить ваш протеин интереса)

HRP - Пероксидаза Редиски Лошади

Luminol - субстрат HRP колет для того чтобы причинить светлому образованию

Ecl - увеличенная хемолюминесценция (западное разрешение помаркой увеличивает светлое образование от HRP + Luminol)

kD/kDa - kilodalton (большинств средний протеинов между kDa 30 до 80)

ШТОССЕЛЬ - анти-myw6 Ig кролика

Isotype антитела Ig - Immunoglobulin(an)

NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - фторид phenylmethylsulfonyl

BSA - Альбумин Сыворотки Bovine

NFDM - non-fat сухое молоко

[верхняя часть]

[верхняя часть]